[發(fā)明專利]一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610109787.4
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號: CN105647937A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉偉治;徐平平;苗艷;包振民;王師;張玲玲;甘旭華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué);青島衛(wèi)遼醫(yī)用生物材料有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 北京國智京通知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，特別是一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法及應(yīng) 用。

背景技術(shù)

浩瀚的海洋是一座巨型生物寶庫，包含著成千上萬的已知或未知的陸生 生物所不具有的獨(dú)特的生物資源。許多海洋生物在漫長的進(jìn)化過程中形成了 各種各樣的黏附作用以適應(yīng)和對抗動態(tài)的海洋環(huán)境，這在潮間帶的生物類群 中表現(xiàn)尤為突出。海洋無脊椎動物可暫時或永久性的吸附于各種生物或物體 表面，它們進(jìn)化出了獨(dú)特的黏附機(jī)制以促進(jìn)吸附作用。海洋多毛類 Phragmatopomacalifornica能夠用分泌出的蛋白黏附劑混合海底的貝殼及沙 粒制造保護(hù)性的管子。這種黏附劑可以廣泛黏附海洋中的多種材料。刺參 Holothuriaforskali在受到驚嚇時可以防御性地排出許多管狀物(Cuvierian tubules)，生化鑒定表明這些管狀物所含蛋白質(zhì)與糖類的比例為3比2，并且 所含的不溶性蛋白比例很大。可溶性的蛋白包括十種富含酸性氨基酸的蛋白， 分子量從17到220kD。藤壺直接永久性地黏附于海洋水下基質(zhì)表面(船體， 采油平臺及管道等)。藤壺幼蟲的初始黏附是通過氧醌連接將二羥苯丙氨酸 (多巴，Dopa)組裝在一起，這也包括海洋貽貝Mytilusspp.的黏附蛋白， 而成體的黏合劑實(shí)質(zhì)上與幼體有很大差別，其中富含絲氨酸、蘇氨酸和甘氨 酸。這三組蛋白質(zhì)中疏水性和親水性的殘基交替排列，這些基序被認(rèn)為是在 海水中蛋白的裝配中起著重要的作用。海水及淡水貽貝科黏附蛋白與藤壺的 黏合蛋白有所不同，因?yàn)樗陌被峄蚺c藤壺不同(主要以含有大量 多酚蛋白成分為特征)，貽貝黏附蛋白含有大量的修飾過的3，4-Dopa，以及 對特定氨基酸的化學(xué)修飾(羥基化)。目前從紫貽貝M.edulis中已鑒定出至 少十種與黏附作用相關(guān)的蛋白，這也反映出了對這種生物黏附結(jié)構(gòu)研究的得 心應(yīng)手，以及其作為仿生學(xué)研究目標(biāo)的趨勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種扇貝足絲蛋白體外表達(dá)方法及應(yīng)用，以提供 生物仿生研究思路，為生物材料拓展新的研究方向。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種扇貝足絲 蛋白體外表達(dá)方法，其特征在于，包括了蛋白的質(zhì)譜鑒定，具體操作步驟如 下：

扇貝足絲蛋白的采集：將市售的櫛孔扇貝培養(yǎng)在19℃恒溫循環(huán)海水的條 件下，每隔一天用干凈手術(shù)刀片對黏附在培養(yǎng)籠中的足絲纖維蛋白進(jìn)行刮取， 進(jìn)行足絲全蛋白的收集，收集到的足絲纖維置于-20℃冰箱內(nèi)保存；

扇貝足絲蛋白的粗提取：將收集到的扇貝足絲蛋白干粉在液氮中研磨成 粉末，分裝到1.5mLEP管中，加入30μL5％醋酸-鹽酸胍裂解液，37℃金屬浴 抽提足絲蛋白30分鐘，然后于20,000g4℃高速離心30分鐘，取上清，作為 扇貝足絲黏附蛋白粗提液；

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定：將提取的蛋白質(zhì)透析濃縮后按照每100μg蛋白質(zhì)底物 加入3.3μg酶的比例加入1μg/uL的Trypsin，37℃水浴24小時，利用 Q-Exactive質(zhì)譜儀檢測消化后得到的肽段溶液中的肽段信號，以實(shí)驗(yàn)室自己 建立的櫛孔扇貝足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為模板，對質(zhì)譜檢測到的肽段序列進(jìn)行搜索；

體外表達(dá)：基于足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的ORF，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，利用PCR技 術(shù)獲得目的片段，構(gòu)建其中針對第一段重復(fù)序列的體外重組表達(dá)系統(tǒng)，DNA測 序驗(yàn)證體外重組表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌中進(jìn)行體外 重組表達(dá)。

其中，足絲蛋白中富含PCGGXC(X為任意氨基酸殘基)及CVC片段的多 肽序列。

其中，重組表達(dá)后的蛋白提取方法如下：

將菌體超聲破碎，之后沉淀用PBS洗兩次后1M尿素洗兩次，將沉淀用20mM Tris-HCl/6M(pH8.0)尿素溶解，室溫結(jié)合NickelsBeads(Qiagen)3小 時，20mMTris-HCl/6M尿素(pH8.0)wash，5％HAc/6M尿素(pH3.6)洗 脫，將洗脫后的樣品透析到超純水中，冷凍干燥制備蛋白質(zhì)樣品。

本發(fā)明同時公開了上述扇貝足絲蛋白在醫(yī)用材料制備領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明亦同時公開了上述扇貝足絲蛋白在紡織材料制備領(lǐng)域的應(yīng)用。 本發(fā)明具有以下有益效果：