[發(fā)明專利]一種單克隆抗體藥物的藥代動力學(xué)質(zhì)譜分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610109020.1
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號: CN105572265A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡良海;叢宇婷;楊波;張章;顧景凱
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 王恩遠(yuǎn)

1.一種單克隆抗體藥物的藥代動力學(xué)質(zhì)譜分析方法，所述的單克隆抗體藥 物為貝伐珠單抗；按如下7步驟進(jìn)行血漿樣品中單抗?jié)舛鹊臏y定；

(1)血漿樣品的還原：于聚乙烯管中加入2μL大鼠的血漿樣品，加入96μL 含有變性劑的pH緩沖液，渦流混勻；加入2μL還原劑，渦流混勻；60℃孵育1 小時，得到反應(yīng)液；

(2)半胱氨酸的封閉：于反應(yīng)液中加入0.75mg固體半胱氨酸封閉劑，渦 流混勻；25℃避光孵育40min；

(3)血漿樣品的胰酶消化：經(jīng)半胱氨酸封閉的反應(yīng)液中加入700μL消化 緩沖液，渦流混合，再加入3μL胰酶溶液，渦流混合，37℃孵育12～16h得到 血漿樣品酶解液，加入5μL甲酸終止反應(yīng)；

(4)內(nèi)標(biāo)的引入：于酶解液中加入10μL穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽段，渦 流混勻，得到血漿樣品的反應(yīng)液；

(5)血漿反應(yīng)液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液 體自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液體自然流完；取血漿樣 品的反應(yīng)液，至液體自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液體自 然流完，3遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脫溶液，至液體自然流完，得血 漿樣品洗脫液，置于聚乙烯管中；

(6)血漿樣品的濃縮復(fù)溶：將血漿樣品洗脫液真空離心蒸干，加入100μL 0.1％甲酸，渦流混勻，得到血漿樣品的復(fù)溶液；

(7)血漿樣品的質(zhì)譜分析：取血漿樣品復(fù)溶液2μL進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜分析，記錄色譜圖，將所選的特異性肽段峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲 線y＝0.000239987+0.0684449x，其中，x為特異性肽段峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值， y為以ng/μL為單位的單抗?jié)舛龋蟮秒亩螡舛龋穗亩螡舛燃礊閷?yīng)血漿樣品 中貝伐珠單抗?jié)舛取?

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學(xué)質(zhì)譜分析方法，其 特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.000239987+0.0684449x，建立過程有標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 的配置和大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備；

所述的單抗標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配置，是利用去離子水將單抗標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液 (25μg/μL)分別稀釋至5、10、40、100、500、1000、1200ng/μL；

所述的大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備，有如下7步驟，

(1)大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的還原：于聚乙烯管中分別加入2μL上述步 驟中的單抗標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；加入2μL大鼠的空白血漿，渦流混勻；加入94μL 含有變性劑的pH緩沖液，渦流混勻；加入2μL還原劑，渦流混勻；60℃孵育1 h，得到反應(yīng)液；

(2)半胱氨酸的封閉：于反應(yīng)液中加入0.75mg固體半胱氨酸封閉劑，渦 流混勻；25℃孵育避光40min；

(3)大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的胰酶消化：經(jīng)半胱氨酸封閉的反應(yīng)液中加入 700μL消化緩沖液，渦流混合，再加入3μL胰酶溶液，渦流混合，37℃孵育12～16 h得到單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品酶解液，后加入5μL甲酸終止反應(yīng)；

(4)內(nèi)標(biāo)的引入：于單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品酶解液中加入10μL穩(wěn)定 同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽段，渦流混勻，得到單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品反應(yīng)液；

(5)單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品反應(yīng)液的固相萃取：于固相萃取柱中加入 1mL乙腈溶液，至液體自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液體 自然流完；取步驟(4)得到的單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品反應(yīng)液加入到固相萃 取柱中，至液體自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液體自然流 完，三遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脫溶液，至液體自然流完，得單抗大 鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品洗脫液，置于聚乙烯管中；

(6)單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的濃縮、復(fù)溶：將單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品洗脫液真空離心蒸干，加入100μL0.1％甲酸，渦流混勻，得到單抗大鼠血 漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品復(fù)溶液；

(7)單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的質(zhì)譜分析：

取2μL單抗大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品復(fù)溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，記錄色 譜圖，以初始單抗標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中單抗?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，所選的酶解后特異性肽段 峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)W＝1/x²最小二乘法進(jìn)行回歸運算， 求得的直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。