[發(fā)明專利]一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)用于提升單核增生李斯特菌對抗生素敏感性的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610108267.1
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105688186B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐鋒;楊棟;魏華;武曉麗;蔚曉敏;吳姚平
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61K45/06;A61P31/04;A61K31/43;A61K31/7036
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 劉華

本發(fā)明提供了一種來源于長雙歧桿菌的粘附蛋白，并明確了其氨基酸序列；在此基礎(chǔ)上實驗發(fā)現(xiàn)該粘附蛋白不僅能夠粘附于腸上皮細(xì)胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，特別是對單核增生李斯特菌，這種抗生素增效作用尤為突出?；谶@種有益的發(fā)現(xiàn)，確定了該蛋白作為單核增生李斯特菌抑菌增效劑的用途，從而擴(kuò)展了其用途范圍，同時提供了一種提升微生物藥敏性的新途徑。本發(fā)明基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炇侄潍@得了突出的技術(shù)效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)用于提升單核增生李斯特菌對抗生素敏感性的應(yīng)用。

背景技術(shù)

雙歧桿菌作為腸道益生菌廣為人知，近年來針對其腸道益生作用研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌的某些代謝產(chǎn)物能夠抑制其他微生物在腸道內(nèi)壁的定植，進(jìn)而降低病原微生物的侵害風(fēng)險。該特征目前已經(jīng)成為篩選雙歧桿菌菌種、研發(fā)功能性益生菌菌劑的重要依據(jù)。

現(xiàn)有技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌對其他微生物定植于腸道內(nèi)壁的抑制機(jī)制主要是通過分泌有機(jī)酸降低腸道pH值，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，同時分泌胞外酶從而影響致病菌或細(xì)菌毒素的黏附位點(diǎn)及其特異性受體。此外，近年來有學(xué)者認(rèn)為，由雙歧桿菌自身黏附于腸道所引發(fā)的占位效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)可能是阻礙致病菌黏附和入侵的一個重要因素。黏附蛋白作為雙歧桿菌黏附并定植于胃腸道上皮的重要因子，其物質(zhì)基礎(chǔ)、代謝特性在現(xiàn)有技術(shù)中尚無明確結(jié)論，

盡管現(xiàn)有技術(shù)中曾報道部分具有粘附性的雙歧桿菌表達(dá)蛋白，但其是否就是菌體定植于腸道內(nèi)壁的功能性物質(zhì)尚不明確；此外，在明確獲得一種雙歧桿菌粘附蛋白的基礎(chǔ)上，為實現(xiàn)進(jìn)一步的應(yīng)用，其表達(dá)量、純化效率應(yīng)當(dāng)?shù)玫絻?yōu)化；再次，針對雙歧桿菌粘附蛋白，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性，從而為該粘附蛋白的其他用途奠定基礎(chǔ)。

長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)是雙歧桿菌屬的一種，屬革蘭氏陽性、無芽孢、不運(yùn)動、厭氧性桿菌，廣泛存在于人體尤其嬰兒的腸道中，屬于藥品、微生態(tài)菌劑制備領(lǐng)域的常規(guī)菌種之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)用于提升單核增生李斯特菌對抗生素敏感性的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中長雙歧桿菌蛋白質(zhì)應(yīng)用范圍存在局限性的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是單核增生李斯特菌對抗生素的敏感性有待提升。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種長雙歧桿菌蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一種上述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：

1)制備長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌表達(dá)菌株；

2)取步驟1)所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，至培養(yǎng)液OD600nm為0.6～0.9時加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.8～1.2mM，而后于35～39℃、震蕩條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4～5h；

3)收集菌體、破碎、收集上清；

4)取步驟3)上清液，利用GST親和層析純化，收集洗脫液后超濾濃縮，脫鹽，干燥，即得到所述長雙歧桿菌蛋白質(zhì)。

作為優(yōu)選，步驟3)所述的破碎是將菌體重懸于PBS緩沖液后，在冰浴條件下超聲破碎20～30次，每次破碎的持續(xù)時間為2～4s，每2次破碎之間的時間間隔為4～6s。

作為優(yōu)選，步驟4)具體包括以下操作：

a)取緩沖液A，以2.5～3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽瓊脂糖樹脂柱；

b)取步驟2)上清液，以1～2mL/min的流速上樣；

c)取緩沖液B，以0.8～1.2mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處溶液即為洗脫液；