[發(fā)明專利]一種質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610107520.1
• 申請(qǐng)日: 2016-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN107129996B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王洪凱;林福呈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/66;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈自軍

1.一種質(zhì)粒載體，由pCAMBIA1300改造構(gòu)建形成，其特征在于，在pCAMBIA1300多克隆位點(diǎn)插入葡萄座腔菌組蛋白H3基因啟動(dòng)子、葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子α基因啟動(dòng)子、抗性基因，所述抗性基因位于葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子α基因啟動(dòng)子的下游；

所述葡萄座腔菌組蛋白H3基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子α基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或所述葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子α基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰颍?/p>

所述葡萄座腔菌組蛋白H3基因啟動(dòng)子下游插入報(bào)告基因，所述報(bào)告基因?yàn)镚FP基因。

2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)擴(kuò)增分別包含所述葡萄座腔菌組蛋白H3基因啟動(dòng)子、所述葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子α基因啟動(dòng)子和所述抗性基因的DNA片段；

(2)通過重組反應(yīng)將所述DNA片段插入到pCAMBIA1300載體的多克隆位點(diǎn)，得到所述的質(zhì)粒載體；

所述抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰颍O(shè)計(jì)引物如下：

擴(kuò)增葡萄座腔菌組蛋白H3基因啟動(dòng)子的引物為：

上游引物：CATTATTATGGAGAAACGGCAGCAGAAAGGGTTGAGAC；

下游引物：CCTCGCCCTTGCTCACCATGCAGAAGTTGTGTTGGGTCGG；

擴(kuò)增葡萄座腔菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子α基因啟動(dòng)子的引物為：

上游引物：CTGTACAAGTAATCTAGATCGAGAGTGGAGAGTGGCGAGAAA；

下游引物：GTGAGTTCAGGCTTTTTCAT TGTAGAGGCTGAGGTGTCTG；

或

上游引物：CTGTACAAGTAATCTAGAGGAGTCATACCGTGAACA；

下游引物：GTGAGTTCAGGCTTTTTCAT TGTAGAGGCTGAGGTGTCTG；

擴(kuò)增抗性基因的引物為：

上游引物：ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG；

下游引物：ACGACGGCCAGTGCCACATCTACTCTATTCCTTTGCCC；

所述葡萄座腔菌組蛋白H3基因啟動(dòng)子下游插入GFP基因，擴(kuò)增GFP基因的引物為：

上游引物：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG；

下游引物：TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG。