[發明專利]一種制備多孔酶微球的方法

在審

• 申請號: 201610107152.0
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN105543210A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 周麗亞;高靜;姜艷軍;崔翠翠
• 申請（專利權）人: 河北工業大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 天津翰林知識產權代理事務所(普通合伙) 12210
• 代理人: 趙鳳英

技術領域

本發明屬于固定化酶領域，特別是一種制備多孔酶微球的方法。

背景技術

面對越來越嚴重的環境危機和能源危機，環境友好型的催化劑逐漸被大家認同。酶催化 因其具有反應條件溫和、專一性強、效率高等優勢而得到越來越多的關注。但是，游離酶對 所處環境十分敏感，在強堿、強酸、高溫及部分有機溶劑中不夠穩定，容易變性失活。而酶 的固定化不僅可提高酶的穩定性，還有利于酶的回收和重復利用及連續自動化生產，這對降 低生產成本，提高生產效率具有重要意義。酶的固定化分為載體固定化與無載體固定化兩大 類。通常來說，載體固定化酶可提高酶的機械強度和穩定性，但由于大量惰性載體的存在， 嚴重降低了單位體積內酶的濃度，還存在傳質阻力大、酶的活性不高等問題。另外，固載化 材料的制備過程較復雜，成本較高，對于某些特殊載體，不但價格昂貴，而且對生產設備和 生產條件要求也很苛刻，不利于大規模工業化生產。因此，無載體酶固定化技術就顯得很有 吸引力。

無載體酶固定化技術中，交聯酶聚集體方法因其操作簡單，對實驗條件要求低，酶的固 載效率和回收率高，且適用于大多數酶的固定化而被廣泛應用，但該方法制備的無載體固定 化酶也存在一定問題，如交聯酶聚集體顆粒大小不均，可控制備性差，不利于交聯酶聚集體 工業化應用中高催化活性的發揮和后期的分離等；針對這些問題，Brady等(BMCBiotechnol., 2008,8,8～18)提出了球化無載體固定化酶技術，利用乳化法可以制備出0.5-10μm的球 形脂肪酶微粒，此球形微粒可進一步團聚形成100μm左右的團聚體，在一定程度上實現了 無載體固定化酶的可控制備，顆粒呈現球形，形貌規則，但是該脂肪酶微粒為無孔結構。 Lopez-Serrano等(Biotechnol.Lett.,2002,24,1379～1383)在制備脂肪酶交聯酶聚集 體時，添加十二烷基硫酸鈉、辛基酚聚氧乙烯醚和冠醚添加劑，沉淀交聯后，添加劑被去除， 得到有孔的交聯酶聚集體，但孔徑很小且不可控。王夢凡等(BioresourceTechnol.,2011, 102(3),3541～3545)采用大分子淀粉為致孔劑，制備得到多孔化交聯酶聚集體，該多孔化結 構有利于降低交聯酶聚集體對底物分子的傳質限制，提高了無載體固定化酶的催化效率，但 該方法制備的固定化酶微粒孔徑和粒徑可控性差。為避免這些缺陷，一種新的方法應運而生 ---模板法制備多孔固定化酶微粒。該方法因其固定化酶制備簡單、重復率高、形態可控、適 用面廣而被廣泛應用于固定化生物分子(Chem.Mater.,2008,20(3),738～755)。生物分子 通過滲透入到模板內部，其后去除模板，而獲得精確復制模板形貌的多孔生物分子顆粒，且 生物分子顆粒的性質可以通過簡單選擇不同形式的模板來調控。然而該方法也有一定缺陷， 即模板去除過程通常涉及苛刻的條件，如聚合物(TopicsinCurrentChemistry-Templates inChemistryⅢ,2009,287,135～180)或二氧化硅模板的去除(Adv.Mater.,2006,18(6), 795～800)需經過高溫分解或氫氟酸來去除，還有一些模板的去除涉及到有機溶劑，這些條件 或試劑會破壞生物分子的結構，造成其不可逆失活，同時也會由于溶脹或坍塌而破壞模板的 支架。因此，要想利用模板技術獲得功能化的生物分子顆粒，需要找到一種可以在水相溫和 條件下去除的合適的模板。多孔碳酸鈣或碳酸錳顆粒具有生物相容性，不僅價廉易得，還有 良好的穩定性，同時也可以在溫和條件下溶解。此外，通過對兩種顆粒的粒度分布和內部形 貌的研究發現，其適合作為生物分子的模板。Volodkin課題組利用層層自組裝技術在溫和的 模板去除條件下制備了聚合物微囊(J.Mater.Chem.,2004,14(14),2073～2081)。該課題 組(Adv.Funct.Mater.,2013,23(1),116～123)又在制備介孔碳酸鈣模板的基礎上，加 入蛋白質，蛋白質分子靠水分子的蒸發以及毛細管作用進入到碳酸鈣孔道內部，而后經戊二 醛交聯和模板去除等步驟制備了多孔性蛋白質微粒，該方法制備的多孔蛋白質微粒形貌更規 整，適用于大多數蛋白質(或酶)的多孔微粒制備。但該制備過程比較復雜、孔狀蛋白質微 粒易塌陷，且過程中加入了戊二醛交聯劑交聯蛋白質分子，戊二醛的存在會導致酶的活性降 低，微粒形貌、粒徑可控制備性差。

發明內容