[發(fā)明專利]一種高效定點轉(zhuǎn)基因的工具及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610104256.6
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105646719B
• 公開（公告）日: 2019-12-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方銳;趙馨;陳道貞;蔡立義;肖建平
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫市婦幼保健院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/22;C12N15/85
• 代理公司: 11002 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王文君

1.一種高效定點轉(zhuǎn)基因的載體，其特征在于，所述載體包含：

1)可轉(zhuǎn)錄tracrRNA和crRNA的核苷酸序列；

2)編碼雙突變Cas9蛋白的核苷酸序列；所述雙突變Cas9蛋白為第十位氨基酸殘基D突變?yōu)锳、第840位氨基酸殘基H突變?yōu)锳的Cas9蛋白；

3)編碼PB轉(zhuǎn)座酶的核苷酸序列；

所述載體的表達產(chǎn)物中，tracrRNA與crRNA的重復(fù)序列配對形成RNA二聚體gRNA，雙突變Cas9蛋白與PB轉(zhuǎn)座酶之間通過6個串聯(lián)重復(fù)的GGS肽鏈連接，gRNA引導(dǎo)雙突變Cas9蛋白與PB轉(zhuǎn)座酶靶向作用于基因組特定位點；

所述tracrRNA與crRNA在U6和H1啟動子的驅(qū)動下轉(zhuǎn)錄；

所述載體從5’到3’端依次為U6啟動子驅(qū)動crRNA表達框，CMV啟動子驅(qū)動Cas9蛋白-PB轉(zhuǎn)座酶融合蛋白表達框，H1啟動子驅(qū)動tracrRNA框。

2.一種高效定點轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的載體，與含有外源目的基因的載體共轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。

3.權(quán)利要求1所述的載體在高效定點轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用。