[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610102424.8
• 申請(qǐng)日: 2016-02-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105483034B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 元英進(jìn);謝澤雄;李炳志
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，外源導(dǎo)入的MAT片段對(duì)該雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法可高效、快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母單倍體交配型，不依賴釀酒酵母自身染色體結(jié)構(gòu)HMLα和HMRa，無(wú)需經(jīng)過(guò)二倍體釀酒酵母階段，且無(wú)需對(duì)待轉(zhuǎn)換釀酒酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)等處理，直接獲得相反交配型釀酒酵母菌株，實(shí)驗(yàn)周期短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，尤其是涉及一種快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型的方法。

背景技術(shù)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又稱面包酵母或出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母具有單倍體和雙倍體兩種常見(jiàn)生活方式。單倍體的生活史較簡(jiǎn)單，通過(guò)有絲分裂繁殖。在環(huán)境壓力較大時(shí)通常則死亡。二倍體細(xì)胞(酵母的優(yōu)勢(shì)形態(tài))也通過(guò)簡(jiǎn)單的有絲分裂繁殖，但在外界條件不佳時(shí)能進(jìn)入減數(shù)分裂，生成一系列單倍體的孢子。單倍體可以交配，重新形成二倍體。它們之間的轉(zhuǎn)換可通過(guò)交配(單倍體孢子融合產(chǎn)生雙倍體)和孢子形成(雙倍體減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體孢子)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而這些變化的發(fā)生則是由菌株的交配型所決定。釀酒酵母的交配型是由位于酵母染色體Ⅲ上MAT基因座控制的，MAT基因座包括兩個(gè)等位基因MATa和MATα，因此將釀酒酵母單倍體菌株的交配型(mating-type)分為兩種：MATa和MATα。

釀酒酵母MATa和MATα兩種交配型的轉(zhuǎn)換主要由HO基因的產(chǎn)物引起的。HO基因在自身啟動(dòng)子作用下表達(dá)Ho蛋白，該蛋白會(huì)在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，激活Ⅲ號(hào)染色體兩端的沉默的HMLα或者HMRa基因座將自身的Yα或者Ya序列復(fù)制至MAT基因座處修補(bǔ)雙鏈斷裂。在此過(guò)程中，釀酒酵母菌株的交配型發(fā)生了轉(zhuǎn)換(圖1)。

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室菌株的HO基因己積累了很多突變或者進(jìn)行了基因失活處理，故不能自發(fā)的發(fā)生交配型的轉(zhuǎn)換過(guò)程，而交配型的相互轉(zhuǎn)化卻是酵母研究的重要手段。

交配型轉(zhuǎn)換的傳統(tǒng)方法為將載有HO基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到這些細(xì)胞中，誘使這些細(xì)胞發(fā)生交配型的轉(zhuǎn)換。不過(guò)利用HO基因誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞交配型的轉(zhuǎn)換后，異種交配型細(xì)胞會(huì)立刻相互接觸從而產(chǎn)生二倍體細(xì)胞，因此還需要進(jìn)行生孢實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得單倍體菌株，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題提供一種快速轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型的方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座處產(chǎn)生雙鏈斷裂，外源導(dǎo)入的MAT片段對(duì)該雙鏈斷裂進(jìn)行修補(bǔ)，轉(zhuǎn)換釀酒酵母交配型。

其中，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法具體操作為將釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn)化體系混合進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，然后篩選，分純；其中所述釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞為包含pRS415+Cas9質(zhì)粒的釀酒酵母菌株，所述轉(zhuǎn)化體系包含質(zhì)粒DNA，所述質(zhì)粒DNA包括guide-RNA質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶NsiI消化的MAT基因表達(dá)盒質(zhì)粒片段。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)換酵母交配型的方法中所述感受態(tài)細(xì)胞的制備方法為挑取攜帶pRS415+Cas9質(zhì)粒的酵母菌株單菌落于SC-Leu液體培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后接種過(guò)夜培養(yǎng)液到Y(jié)PD中30℃、220rpm條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.5，離心，收集細(xì)胞；用0.1MLiOAc重懸細(xì)胞，離心，吸除部分上清，剩余的LiOAc重懸細(xì)胞，置于冰上，得到感受態(tài)細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述感受態(tài)細(xì)胞為包含質(zhì)粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741感受態(tài)細(xì)胞。