[發明專利]鰩血管生成抑制因子1的適配子K14及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201610101224.0
• 申請日: 2014-06-06
• 公開（公告）號: CN105541988B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 張壘;張勇
• 申請（專利權）人: 浙江藥苑生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 北京艾皮專利代理有限公司 11777
• 代理人: 楊克

一組能識別鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的適配子及其制備方法。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.2～11，其分別具有較高的親和特異性，可以用于鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種鰩血管生成抑制因子1適配子及其篩選方法和應用。

背景技術

近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是由SELEX技術(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)生物文庫技術篩選獲得的，該技術的原理就是利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其隨機序列長度在20-100個堿基左右。利用單鏈寡核苷酸分子構像靈活多變的特性，將隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留以空間構像與靶分子結合的寡核苷酸，經反復擴增、篩選數個循環，即可使與該靶子特異結合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得多種靶分子的特異寡核苷酸適配子，即aptamer。利用SELEX技術篩選獲得的aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，核酸類配基具有更多的優越性，如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運輸等。更重要的是，aptamer比抗體具有更高的特異性，甚至能識別單抗不能區分的蛋白質分子。而且aptamer的靶分子非常廣泛，小至染料分子，大至完整的病毒顆粒和細菌病原體，甚至完整的細胞也可以通過消減SELEX技術篩選出高親和力的寡核苷酸適配子。

鰩血管生成抑制因子1功能區以下簡稱鰩功能區，鰩血管生成抑制因子1是我們首次從南海海域一種鰩組織中分離出來的蛋白質(分子量42KD)。研究結果顯示：鰩血管生成抑制因子1顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細胞誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生成；無論是腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生長和轉移，減少腫瘤組織微血管密度，下調促血管生成因子VEGF的表達；對裸小鼠黑色素瘤B16細胞的轉移也有強抑制作用；下調促轉移因子CD44v6和ErBb2的表達；與5-氟尿嘧啶(5-FU)聯合應用時效果更顯著。鰩血管生成抑制因子1的作用靶點與美國基因技術研究所開發出的抗癌新藥Avastin不同。Avastin是基因工程產品，是VEGF的抗體，其作用靶點是VEGF；鰩血管生成抑制因子1是天然產物，它不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和PDGF。因此，針對鰩血管生成抑制因子1功能區進行特異性的鑒別和篩選是本領域一貫的追求。

基于以上考慮，本發明以鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白為目的靶蛋白，采用SELEX技術獲得了10條鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白特異的aptamer，組合應用能夠迅速、敏感、特異的檢測到鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白。由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩定、合成方便且廉價、經修飾后可直接用于熒光或化學發光、發色方法檢測靶綁帶，因此操作簡單、直接。

發明內容

本發明的目的在于提供不僅具有檢測快速、操作簡單、穩定性高于抗體等特點，而且制備方法容易、制備周期較短的一組能識別鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核苷酸序列及其制備方法。

所述能識別鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQ IDNo.2-11，且采用其中的一條寡核苷酸序列就能完成對鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的識別檢測；

所述一組能識別鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白的寡核苷酸序列的制備方法包括以下步驟：

1、合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC----

N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35為35個隨機寡核苷酸；

2、將寡核苷酸文庫分別與鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白混合后進行SELEX篩選，獲得適配子富集文庫；