[發明專利]一種牛支原體MbovP579蛋白及其應用

在審

• 申請號: 201610101212.8
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN107118262A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 郭愛珍;安瓦爾;趙剛;費薩爾;陳曦;陳穎鈺;胡長敏;陳煥春
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K14/30
• 分類號: C07K14/30;C12N1/21;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于動物傳染病防治技術領域，具體涉及到一種牛支原體MbovP579蛋白及其應用。所述的蛋白可以作為抗原蛋白應用于制備牛支原體感染診斷試劑盒中。

背景技術

牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一種主要引起任何月齡肉牛和奶牛呼吸系統疾病和關節炎的重要病原，主要臨床癥狀為肺炎，還可導致乳腺炎、關節炎、生殖道炎癥、結膜炎、中耳炎等多種癥狀，發病率為40％，死亡率為10％。牛支原體于1961年首次在美國從患乳房炎奶牛的牛奶中分離得到，1976年證實其是導致肺炎的重要病原體。2008年，湖北省從外地引進肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引進后2周左右發病，表現為發熱，咳嗽，流鼻涕，犢牛和體質弱的牛發病嚴重，華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室病毒分室于2008年率先確定該病為“傳染性牛支原體肺炎”。由于我國養牛業向規模化和集約化發展，牛養殖量大大增加，專門化程度大幅度提高，肉牛“異地育肥”已經成為重要的肉牛養殖模式。不同研究機構均證實該病在全國范圍內流行，這與近些年的肉牛養殖模式不無關系。

牛支原體是影響養牛業健康發展的重要疾病，大部分感染牛支原體的牛呈亞臨床癥狀或隱形感染，在應激條件下可以引起臨床癥狀。目前長距離運輸是“異地育肥”的重要環節，作為一種重要的應激因素，這無疑將會給肉牛的健康養殖帶來更大的困難。目前國內沒有牛支原體的診斷試劑盒，實驗室一般采取包被牛支原體的全菌蛋白檢測臨床血清樣本，這種檢測方法的特異性和靈敏性都不高。目前的診斷方法已經不能滿足牛支原體防控的需求，因此迫切需要找到牛支原體診斷的特異性靶標，開發出特異性和敏感性高的檢測試劑盒。本申請人所在的農業微生物學國家重點實驗室病毒分室通過雙向電泳和免疫印跡技術發現牛支原體膜蛋白MbovP579蛋白具有很強的免疫原性，并成功地將MbovP579蛋白作為牛支原體血清抗體檢測的分子靶標。

發明內容

本發明的目的在于提供一個可以診斷牛支原體感染與否的分子標識MbovP579蛋白。

本發明的另一個目的在于提供一種檢測牛支原體MbovP579蛋白抗體的特異性檢測方法，用于區分牛支原體感染與否及評價疫苗抗體反應。更進一步，本發明的目的還包括重組MbovP579蛋白(即：rMbovP579)在制備牛支原體感染診斷或疫苗抗體反應檢測試劑盒中的應用。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施和路線：

申請人于2008年6月從湖北省應城市某養牛場發病的黃牛的肺組織中分離得到一株牛支原體本地分離株HB0801，申請人將其命名為牛支原體HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO：M2010040。

根據大腸桿菌對密碼子的偏愛性，本發明以牛支原體HB0801(基因組在GenBank上的登錄號為CP002058)中Mbov_579基因為模板克隆該基因，同時根據大腸桿菌的密碼子偏愛性，將Mbov_579基因進行克隆修飾，將牛支原體色氨酸密碼子UGA突變成大腸桿菌中的色氨酸密碼子UGG進而在大腸桿菌中表達。

經過人工突變后的牛支原體基因Mbov_579的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:13的1-2387位堿基所示的序列，其長度為2387bp；其中在該序列的：165位，690位，1455位和1674位發生等位基因突變。

該牛支原體MbovP579蛋白的蛋白質序列如序列表SEQ ID NO:14所示，共編碼728個氨基酸。

將本發明的牛支原體Mbov_579基因的核苷酸序列通過構建質粒載體pET-30-Mbov_579轉化大腸桿菌DH5α得到重組的大腸桿菌菌株，申請人將該重組的大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌pET-30-Mbov-579；Escherichia coli pET-30-Mbov-579，于2015年12月18日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO：M2015763。該菌株的IPTG誘導下，表達Mbov-579基因編碼的重組蛋白rMbovP579。

經過驗證，本發明純化的rMbovP579蛋白可以作為診斷抗原在制備牛支原體感染診斷試劑盒中的應用。

本發明所述的牛支原體rMbovP579蛋白在區分牛支原體感染中的應用，包括下列步驟：