[發明專利]一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法

在審

• 申請號: 201610100033.2
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105669861A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 王秉;游秋實;劉意;劉楊
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于采用如下步驟：

a.特征診斷序列的合成：采用Fmoc多肽固相合成法合成特征診斷序列，并在所述特征診斷序 列的C端增加半胱氨酸殘基用于偶聯反應；

b.特征診斷序列與載體的偶聯：選擇血藍蛋白作為載體蛋白，用SPDP連接法將所述特征診 斷序列與所述血藍蛋白進行偶聯制得完全抗原；

c.初次免疫：用生理鹽水將步驟b制得的完全抗原進行稀釋，將稀釋后的完全抗原與完全 弗氏佐劑按體積比1:(0.8-1.1)混合，然后加入青霉素和鏈霉素進行乳化處理，得到初次免 疫抗原乳化液；使用初次免疫抗原乳化液對兔子進行皮下多點注射，進行初次免疫；

d.抗血清制備：用生理鹽水將步驟b得到的完全抗原進行稀釋，將稀釋后的完全抗原與不完 全弗氏佐劑按體積比1:(0.8-1.1)混合，然后加入青霉素和鏈霉素乳化處理，得到強免疫抗 原乳化液；在初次免疫后的第3周和第5周時，分別使用強免疫抗原乳化液對兔子進行皮下 多點注射，進行加強免疫；在進行初次免疫后的第7周和第9周時，重復進行加強免疫，當 兔子血樣中的抗體效價達到1：20000時，收集兔子血液，并分離制得抗血清；

e.山羊毛檢測抗體的純化：將蛋白A填料與磷酸鹽緩沖溶液混合，攪拌后抽真空20-25min， 得到無氣泡的蛋白A填料液；將蛋白A填料液在無氣泡條件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱； 對蛋白柱進行清洗；對上述制得的抗血清進行稀釋，稀釋后加入到蛋白柱中進行上樣，重復 上樣一次；對蛋白柱再次清洗，用甘氨酸溶液對抗體進行洗脫，洗脫后清洗蛋白柱，制得抗 體。

2.如權利要求1所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，步 驟a中所述的特征診斷序列為如序列表SEQIDNo.1所示的氨基酸序列PVSCEATICE。

3.如權利要求1所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，步 驟c中稀釋后的完全抗原的濃度為0.8-1.2mg/mL。

4.如權利要求3所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，步 驟d稀釋后的完全抗原的濃度為0.25-0.75mg/mL。

5.如權利要求1所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，在 進行初次免疫、加強免疫時，每個注射點的注射量為100μL。

6.如權利要求1所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，在 步驟d中，從血液中分離得到抗血清的方法為：將收集到的血液置于室溫下凝固，然后將凝 固血液置于36-38℃的溫箱內放置25-35min，再置于4℃的冰箱中11-13h，使血塊充分收縮并 得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃環境中，在3000g條件下離心14-16min， 取上清液，放置于-80℃儲存備用。

7.如權利要求1所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，步 驟e的具體過程為：將蛋白A填料與磷酸鹽緩沖溶液按1.5g/(6-7)mL的配比混合，攪拌后 抽真空20-25min，得到無氣泡的蛋白A填料液；然后將6-7體積份的蛋白A填料液在無氣 泡條件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20體積份的磷酸鹽緩沖溶液對蛋白柱進行清洗， 清洗流速為60mL/h；用磷酸鹽緩沖溶液將15體積份的抗血清稀釋至20體積份，稀釋后加入 到蛋白柱中進行上樣，重復上樣一次；用30體積份的磷酸鹽緩沖溶液對蛋白柱再次清洗，清 洗流速為60mL/h；用濃度為0.2mol/L、pH為3.0的甘氨酸溶液對抗體進行洗脫；洗脫后用磷 酸鹽緩沖溶液洗滌蛋白柱，制得抗體，將抗體裝于離心管中并于4℃保存待用。

8.如權利要求7所述的一種利用特征診斷序列制備山羊毛檢測抗體的方法，其特征在于，步 驟e中所用的磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.05mol/L，pH為7.4。