[發明專利]STAT1重組表達質粒及其制備方法

在審

• 申請號: 201610099784.7
• 申請日: 2016-02-24
• 公開（公告）號: CN105505978A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 許國雄;管文彩;田曉玲
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬金山醫院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，是一種Stat1重組表達質粒及其制備方法。

背景技術

Stat1(signaltransducersandactivatorsoftranscription1，信號轉導及 轉錄活化因子1)是細胞因子/生長因子信號轉導中中藥的胞質轉錄因子。Stat1有兩個亞型 (Stat1α和Stat1β)，Stat1α有兩個磷酸化位點(Tyr701和Ser727)，它的剪輯變體Stat1β 有一個磷酸化位點(Ser727)。Stat1與受體結合從而被磷酸化，激活的Stat1轉移到核內激 活靶基因的轉錄，從而在多種腫瘤中發揮作用。

中國專利201310612966.6公開了一種重組載體及其制備方法和應用，其采用酵母 分泌表達載體pPICZaA構建，含有人源CTLA4胞外區基因，可用于表達人源CTLA4融合蛋白； 該重組載體還含有Kex2蛋白酶酶切位點、His標簽和c-myc標簽，可使得表達的CTLA4融合蛋 白以分泌蛋白的形式釋放到胞外，并對蛋白進行純化，為CTLA4蛋白的工業化生產提供了一 種簡便的方法。中國專利2013105616301公開了一種帶Myc標簽的LAMP1真核表達載體及其 應用，其通過將LAMP1基因與Myc標簽蛋白基因構成融合基因，利用載體上的啟動子和信號 序列來控制融合基因的表達，然后采用免疫沉淀的方式分離溶酶體，操作簡便，富集效率 高，結果易于檢測，成本低，可應用于高效的分離溶酶體。中國專利201310750733.2公開了 一種通用型重組表達載體，該表達載體攜帶有多功能標簽的編碼基因，所述多種功能標簽 為His，c-myc，flag，HA，GST和GFP標簽中的至少一種；其還提供了一種通用型重組表達載體 的構建方法和應用，所述構建方法，簡單，制備成本低，可用于外源蛋白的生產，便于目的蛋 白的表達、檢測、示蹤和純化。但是關于本發明的pStat1α/β-myc/GFP重組質粒，目前還未見 報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供重組質粒pStat1α-myc和pStat1β- myc。

本發明的再一的目的是，如上所述重組質粒的制備方法。

本發明的另一的目的是，提供重組質粒pStat1α-GFP和pStat1β-GFP。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

重組質粒pStat1α-myc和pStat1β-myc，所述重組質粒pStat1α-myc和pStat1β-myc 是通過將PCR擴增的基因片段Stat1α和Stat1β插入到載體pcDNA4/TO/myc-His酶切位點Kpn I和SacII中制備得到的。

所述基因片段Stat1α是采用如下引物擴增得到的：

所述基因片段Stat1β是采用如下引物擴增得到的：

為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：

如上所述重組質粒pStat1α-myc和pStat1β-myc的制備方法，包含如下步驟：

1)PCR擴增獲得Stat1基因；

2)將含有myc-His6片段的載體與步驟1)獲得的含Stat1α和Stat1β基因的PCR產物 酶切，酶切回收的產物采用T4DNA連接酶連接；

3)將步驟2)獲得的連接產物轉化感受態細菌；

4)鑒定陽性克隆，將測序正確的克隆利用無內毒素質粒大提試劑盒進行質粒的大 量制備。

所述步驟1)中的PCR擴增使用的PCR引物如下：

所述步驟2)中含有myc-His6片段的載體為質粒pcDNA4/TO/myc-His。

所述步驟2)中采用KpnI和SacII對PCR產物和載體進行雙酶切，具體酶切反應體 系如下：10xBuffer6μl，KpnI和SacII各8μl，模板(PCR產物或質粒)8μg，再用去離子水 補足至60μl。

為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是：