[發明專利]藻藍蛋白β亞基C端結構域的克隆與表達

在審

• 申請號: 201610098462.0
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105647951A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 歐瑜;張子驥
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C07K19/00;C07K14/795
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及藻藍蛋白β亞基C端結構域的克隆與表達。

技術背景

藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是鈍頂螺旋藻含有的多種生物活性成分之一。它普遍存在于 藍藻細胞中，是一種特殊的捕光色素蛋白，具有抗疲勞、抗輻射、抗病毒、抑制腫瘤、抗過 敏、增強免疫力、清除自由基等多種活性功能。藻藍蛋白由α亞基和β亞基組成。α亞基由 162個氨基酸殘基組成。β亞基由172個氨基酸殘基組成。研究發現，藻藍蛋白尤其是藻藍 蛋白β亞基具有抗炎和抗腫瘤活性。同等摩爾濃度下，藻藍蛋白β亞基較藻藍蛋白和藻藍蛋 白α亞基具有更好的抗腫瘤活性。藻藍蛋白β亞基由六段α螺旋組成，本發明將含有藻藍蛋 白β亞基靠近C端的兩段α螺旋結構域的基因片段用大腸桿菌克隆和表達，為研究該結構域 功能奠定基礎。

發明內容

本發明所述的藻藍蛋白β亞基C端結構域的融合蛋白是通過重組質粒構建后轉化到 感受態大腸桿菌，通過誘導表達，純化所得蛋白而得。其制備方法如下：

從本實驗室保存的含有藻藍蛋白全部β亞基和部分α亞基基因的重組質粒，PCR法 擴增出β亞基C端結構域的基因片段，用內切酶BamHI、HindIII37℃雙酶切β亞基C端結 構域的基因片段和pET-32a質粒1.5h，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的產物再16℃連接16h。 連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞BL21中。工程菌用LB培養基培養到細菌達到對數生長期， 加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG，20℃誘導表達10h。誘導結束后，高速冷凍離心機于 8000rpm，15min離心收集菌體，按照每收集1g菌體加入40ml緩沖液的比例，用緩沖液重懸 菌體。60％功率超聲破碎，并在破碎前加入終濃度為100μg/mL的PMSF以減少蛋白酶的降 解作用。12000rpm，30min收集破碎后的上清液。用鎳親和層析柱分離純化得到藻藍蛋白β亞 基C端結構域的融合蛋白。

附圖說明

圖1為PCR擴增出的藻藍蛋白β亞基C端結構域的基因序列。M：DNAMarker；1： 藻藍蛋白β亞基C端結構域基因。

圖2為菌液PCR擴增出的藻藍蛋白β亞基C端結構域的基因序列。M：DNAMarker； 1：藻藍蛋白β亞基C端結構域基因。

圖3為提取的重組質粒雙酶切驗證。M：DNAMarker；1：雙酶切得到的藻藍蛋白β 亞基C端結構域基因。

圖4為融合蛋白鎳親和層析柱純化結果。M：蛋白marker；1：誘導前菌體；2：誘 導后菌體；3：菌體超聲破碎離心后上清；4：菌體超聲破碎離心后沉淀；5：透析后融合蛋白 鎳親和層析柱純化效果；6：透析前融合蛋白鎳親和層析柱純化效果。

具體實施方式

下面結合一些實例并參照圖表數據對本發明做進一步的說明。應理解，這些實施

例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。

實施例1

含藻藍蛋白β亞基C端結構域基因的重組質粒的構建

選擇藻藍蛋白β亞基C端結構域對應的基因序列克隆，序列長度為153bp。在目的基 因的上下游引物中分別加入BamHI、HindIII酶切位點。用本實驗室保存的含藻藍蛋白全部 β亞基和部分α亞基基因的重組質粒pMD18-T-PC作為模板，并進行PCR擴增β亞基C端結 構域對應基因。PCR反應結束后，產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，如圖1，切下含有目的DNA 的凝膠，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收目的DNA片段。目的基因片段與pET-32a質 粒載體同時雙酶切，取雙酶切產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的DNA的凝膠， 按照凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段。將目的基因片段與雙酶切后的原核表達載體 pET-32a在16℃、16h條件下連接。

實施例2

重組質粒轉化到感受態大腸桿菌BL21中

取連接產物10μl加入到50μl已制備好的大腸桿菌BL21感受態細胞，輕輕混勻 后冰浴30min；42℃水浴中熱激90s后，迅速再次冰浴3min；加入500μlLB液體培養基并 充分混勻，37℃、220rpm振搖培養1h；離心棄上清留取約100μl轉化菌液，涂布于含氨芐 青霉素(Amp+，100μg/mL)的LB固體培養基平板上，37℃培養12-16h。挑取轉化成功的單 克隆進行菌液PCR驗證(圖2)、提取質粒雙酶切驗證(圖3)，并測序。