[發(fā)明專(zhuān)利]梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610098378.9
• 申請(qǐng)日: 2016-02-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105738625A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉莉莉;童曼莉;張惠林;楊天賜;林麗蓉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/571
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/571
• 代理公司: 廈門(mén)南強(qiáng)之路專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟：

1)采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得梅毒螺旋體特異性重組抗原TPN17和TPN47。

2)在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔,作為點(diǎn)樣部位；取抗原混合物加至硝酸纖維素膜上的壓跡中央，干燥；將點(diǎn)樣后的的硝酸纖維素膜片浸于奶粉中封閉；將封閉后之硝酸纖維素膜片置于磷酸鹽緩沖液中漂洗，晾干后得重組抗原包被的硝酸纖維素膜，簡(jiǎn)稱(chēng)快診膜，存放于陰燥處備用；

3)以人γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株，穩(wěn)定分泌抗人γ鏈單克隆抗體。

4)采用過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行抗人γ鏈單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記；

5)將步驟2)中得到的重組抗原包被的硝酸纖維素膜沿壓跡或劃痕剪下,光滑面向上置于聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中，每孔中加入待檢樣品50μL,37℃孵育；

6)在硝酸纖維素膜中加入磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌后棄液體；

7)加入50μL步驟4)中的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的抗人γ鏈單克隆抗體,37℃孵育10min；

8)用磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌后棄液體；

9)顯色：加入3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色劑50μL，37℃放置5min，所述DAB顯色劑按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl緩沖生理鹽水100ml配制；

10)加入磷酸鹽緩沖液洗滌液漂洗，棄液體；

11)結(jié)果判讀，硝酸纖維素膜上斑點(diǎn)呈棕色陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。

2.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔采用直徑6mm的圓形打孔器在硝酸纖維素的光滑面上壓跡成圓形小孔。

3.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述抗原混合物的用量為0.5μL。

4.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述奶粉采用質(zhì)量百分濃度為5％的脫脂奶粉。

5.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述封閉的時(shí)間為30min。

6.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述磷酸鹽緩沖液采用摩爾濃度為0.01mmol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。

7.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟5)中，所述孵育的時(shí)間為10min。

8.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟6)中，所述磷酸鹽緩沖液采用350μL，摩爾濃度為0.01mmol/L，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌可洗滌3次,每次2min。

9.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟8)中，所述磷酸鹽緩沖液采用350μL，摩爾濃度為0.01mmol/L，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌可洗滌3次,每次2min。

10.如權(quán)利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體Dot-ELISA檢測(cè)方法，其特征在于在步驟10)中，所述磷酸鹽緩沖液采用350μL，摩爾濃度為0.01mmol/L，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。