[發明專利]草木樨屬18個物種植物條形碼的目標條形碼基因及其制備方法有效

申請號：	201610097677.0	申請日：	2016-02-23
公開（公告）號：	CN105603095B	公開（公告）日：	2017-07-18
發明（設計）人：	張吉宇;吳凡;駱凱;張代玉;王彥榮	申請（專利權）人：	蘭州大學
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12N15/11
代理公司：	蘭州振華專利代理有限責任公司62102	代理人：	張真
地址：	730000 ***	國省代碼：	甘肅;62
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摘要：
搜索關鍵詞：	草木 18 物種植物條形碼目標基因及其制備方法
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【權利要求書】：

1.一種草木樨屬18個植物條形碼的目標條形碼基因的制備方法，其特征在于包括有以下步驟：

A.通過草木樨的不同生物學特性初步鑒定18個種；

B.幼苗DNA的提取；

C.目標 DNA 條形碼基因的篩選：通過預實驗篩選最終確定 ITS、psbA-trnH、rbcL、 matK、trnL 為目標條形碼基因；

D.目標DNA條形碼基因片段的擴增與測序；

通過預實驗確定 5 個目標基因的反應體系和擴增條件；

總反應體系為 25 μl：2×Reaction Mix 12.25 μl, Golden DNA Polymerase 0.25 μl,正反向引物各 2.5 μl, ddH2O 5 μl,2)中 DNA 模板 2.5 μl；

基于 ITS 基因的特異引物對為，正向基因(5′-3′)：GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG；反向基因(5′-3′)：RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA；

基于 psbA-trnH 基因的特異引物對為，正向基因(5′-3′)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向基因(5′-3′)：CGCGCATGGTGGATTCACAAATC；

基于 rbcL 基因的特異引物對為，正向基因(5′-3′)；AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT；反向基因(5′-3′)：TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA；

基于 matK 基因的特異引物對為，正向基因 (5 ′ -3 ′ ) ； CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC ；反向基因 (5 ′ -3 ′ ) ： GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC；

基于 trnL 基因的特異引物對為，正向基因(5′-3′)；CGAAATCGGTAGACGCTACG；反向基因(5′-3′)：ATTTGAACTGGTGACACGAG；

使用上述特異引物對對草木樨屬18個物種植物基因片段進行擴增與測序；

E.測序結果的核查；

F.序列比對、編輯、質量核查、目標DNA條形碼序列建樹；

G.標準分類DNA條形碼基因及對應序列的確認；

H.標準分類DNA條形碼基因及對應序列準確性驗證；

所述的步驟F，包括基于ContigExpress的數據組織、編輯和分析法及ClustalW的多序列比對法，基于MEGA軟件最小進化原理的Neighbor-Joining算法和no of difference方法構建聚類圖；

所述的步驟G中所述的草木樨屬18個物種植物標準分類DNA條形碼基因對應序列是以下序列1到序列18所示的DNA片段：

序列1的名稱為：M.wolgicus_A1_matK，序列為：

ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactacca

aaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatt

tttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttac

gattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatc

ttgtagaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctca

ttcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttga

tgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctc

aaccaagaac gatcaatata aaccgattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctatt

ttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttc

taatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagat

ccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctggg

ccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct

序列2的名稱為：M.tauricus_A36_matK，序列為：