[發明專利]豬偽狂犬病毒變異株TK、gE和gI基因缺失毒株及其應用

在審

• 申請號: 201610097514.2
• 申請日: 2016-02-23
• 公開（公告）號: CN106834236A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 姜平;董靜;顧真慶;白娟;王先煒;李玉峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/85;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 北京鑫浩聯德專利代理事務所(普通合伙)11380
• 代理人: 李荷香,呂愛萍

1.一種豬偽狂犬病毒變異強毒株TK/gE/gI基因缺失毒株，其特征在于，保藏編號為：CGMCC No.10397。

2.根據權利要求1所述的毒株，其特征為2012年于臨床發病豬分離到的高毒力豬偽狂犬病病毒，其中，ZJ01的GeneBank DNA序列號為KM061380.1。

3.根據權利要求1所述的毒株，其特征為以ZJ01病毒基因組為基礎，敲除其TK、gE、gI基因后所得的人工致弱毒株，結構為ZJ01 TK^-/gE^-/gI^-。

4.根據權利要求1所述的毒株，其特征為以ZJ01病毒基因組為基礎，敲除其TK、gE和gI基因后所得的人工致弱毒株，其中，ZJ01 TK^-/gE^-/gI^-的DNA序列為將ZJ01序列去除本權利要求書中第5、6、7條所述序列后所得序列。

5.根據權利要求1所述的毒株，其中，TK的DNA序列為序列表1的序列。

6.根據權利要求1所述的毒株，其中，gE的DNA序列見序列表2的序列。

7.根據權利要求1所述的毒株，其中，gI的DNA序列見序列表2的序列。

8.權利要求1所述的毒株的制備方法，其特征在于，步驟如下：

使用含有PRV強毒株ZJ01的US7和US8(gE/I)及UL23(TK)基因序列的PCR引物，從pHA2質粒DNA擴增獲得含攜帶細菌人工染色體(BAC)載體和gfp表達盒的基因片段，構建轉移載體pHA2-pUC19-BAC-H1-H2和pHA2-pUC19-UL23-H1-H2，將pHA2-pUC19-BAC-H1-H2與ZJ01毒株全基因組共轉染BHK-21細胞，通過同源重組，獲得重組病毒ZJ01-GFPΔgE/gI，提取該重組病毒基因組DNA，轉化至大腸桿菌宿主菌DH 10B，篩選獲得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。將pZJ01轉染BHK-21細胞可以重新啟動病毒的生產性感染。該pZJ01質粒與pUC19-BAC-H1-H2或gE/gI基因片段全長共轉染BHK-21細胞，通過同源重組刪除mini-F序列，構建獲得gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI。將pHA2-pUC19-UL23-H1-H2與ZJ01ΔgE/gI重組病毒全基因組DNA共轉染BHK-21細胞，通過同源重組，獲得重組病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI，然后刪除mini-F序列，構建獲得TK、gE和gI基因缺失病毒ZJ01ΔTK/gE/gI。