[發明專利]一種視網膜細胞支架生物手術粘合劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201610097502.X
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105597145A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 葛堅;李康寯;魏雁濤
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: A61L24/10
• 分類號: A61L24/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于組織工程領域，具體涉及一種視網膜細胞支架生物手術粘合劑及其制備方法。

背景技術：

視網膜神經元的損傷和修復是神經性視覺損傷發生、發展和轉歸共同的科學問題。近年 隨著干細胞研究的迅速發展，誘導多能干細胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)為視覺神經 損傷的修復與治療帶來了新的希望。由于iPSCs自我復制和多分化潛能，作為修復神經系統 損傷的供體不但能滿足移植時所需的細胞量，而且iPSCs在一定條件下能誘導分化為包括神 經元在內的不同的神經細胞系。因此，利用人源性iPSCs移植治療視覺神經損傷疾病具有重 要的理論意義和良好的臨床治療前景。目前，iPSCs替代治療主要通過以下兩個途徑：1.干細 胞移植入視網膜下腔/玻璃體腔；2.干細胞體外分化為視網膜神經元移植入視網膜下腔/玻璃體 腔。研究發現將iPSCs細胞直接移植到受損的視網膜組織后，90％以上的細胞均分化為星形 膠質細胞，幾乎沒有神經元的存在；而應用iPSCs誘導分化的神經元與宿主視網膜整合性較 差。因此，如何將人iPSCs源性視網膜細胞體外培養，并將其較好地移植整合入受損網膜， 是當前干細胞治療、醫學組織工程學及眼科學領域共同關注的焦點。

發明內容：

本發明的目的是提供一種能將移植的可降解人iPSCs源性視網膜神經支架(iRMP)成功 粘附于宿主視網膜神經層，保證細胞支架眼內有效移植的視網膜細胞支架生物手術粘合劑及 其制備方法。

本發明的視網膜細胞支架生物手術粘合劑，其特征在于，包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、 巢蛋白、人硫酸肝素糖蛋白，成纖維細胞生長因子、基質金屬蛋白酶和磷酸緩沖鹽溶液。

優選，所述的視網膜細胞支架生物手術粘合劑，每毫升含有層粘連蛋白30ng、Ⅳ型膠原 30ng、巢蛋白10ng、人硫酸肝素糖蛋白10ng，成纖維細胞生長因子10ng和基質金屬蛋白酶 10ng，余量為pH＝7的磷酸緩沖鹽溶液。

本發明的視網膜細胞支架生物手術粘合劑的制備方法是：于4℃環境下，按照各組分的 含量，將層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、人硫酸肝素糖蛋白，成纖維細胞生長因子和基質 金屬蛋白酶加入到pH＝7的磷酸緩沖鹽溶液中，混合均勻后得到視網膜細胞支架生物手術粘 合劑。

本發明制備了視網膜細胞支架生物手術粘合劑，利用其能將可降解人iPSCs源性視網膜 神經支架(iRMP)與宿主視網膜神經層粘合，為細胞生物支架與宿主視網膜有效整合提供保 證。本發明將組織工程技術與臨床實際相結合，對再生醫學的基礎研究及眼科學臨床治療均 有一定的理論和實際應用價值，對視神經系統的損傷修復以及神經組織工程學的研究亦產生 積極的推動作用，為組織工程移植治療視覺損傷奠定了理論和實驗基礎。

附圖說明：

圖1是電鏡示PLGA支架孔徑50μm、厚度60μm；

圖2是Matrigel-PLGA內眼移植/細胞共培養支架，直徑4mm，表面積為12.56mm²；

圖3是種子細胞于Matrigel-PLGA內眼移植/細胞共培養支架共培養7天后可見細胞周圍出現 較長突起，形態上類似神經元細胞；

圖4是Matrigel-PLGA內眼移植/細胞共培養支架上神經軸突生長顯著優于對照組，其中PLGA 表示本發明的將種子細胞接種至Matrigel-PLGA內眼移植/細胞共培養支架上于誘導分化培養 基中培養，Coverslip表示將種子細胞接種至載玻片上于誘導分化培養基中培養，Transwell表 示將種子細胞接種至聚碳酸酯膜上于誘導分化培養基中培養；

圖5是iRMP生長14天后的細胞抗體Brn3b(A),HuD(B)及Tju1(C)免疫熒光染色；

圖6是應用膜片鉗技術檢測iRMP的動作電位結果；

圖7是應用生物手術粘合劑將可降解人iPSCs源性視網膜神經支架(iRMP)與宿主視網膜粘 合的設計圖。將iRMP植入宿主眼內，使用生物手術粘合劑可將iRMP與視網膜表層粘附形 成iRP-宿主神經視網膜復合層；

圖8是體外實驗證明該iRP-glue可有效粘合可降解人iPSCs源性視網膜神經支架(iRMP) (A)，24h后生物手術粘合劑降解(B)，使用CCK-8實驗，分光光度值顯示生物手術粘合劑 (iRP-glue)降解產物對細胞無毒性(C)；