[發明專利]腫瘤原代細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201610097498.7
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105647870A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 喻德華;劉佳蘇
• 申請（專利權）人: 深圳市優圣康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.腫瘤原代細胞的培養方法，其特征在于，所述方法是在含 0.1-10mM鈣離子或0.8-30v/v％血清，并添加Rho激酶抑制劑的標準培 養基和飼養層細胞或細胞替代物中培養原代腫瘤細胞和/或飼養層細 胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Rho激酶抑制 劑包括TGF-beta、EGFR、鈣粘素、G蛋白、肌球蛋白磷酸酶抑制劑、 波形蛋白、LIMK、肌球蛋白輕鏈激酶、NHE、鈉/氫交換蛋白-1或肌 球蛋白素中的至少一種；培養基中添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為 5-15μmol/L。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述飼養層細 胞包括來自哺乳動物的脾細胞、巨噬胸腺細胞、纖維母細胞；所述細 胞替代物包括飼養層細胞提取物、條件培養基或甲醇固定的小鼠胚胎 成纖維細胞、纖連蛋白、膠原蛋白、吩噻嗪中的至少一種；所述條件 培養基是指培養過飼養層細胞的培養液。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述飼養 層細胞是經過γ射線輻射或絲裂霉素C處理后，抑制了其增殖性，但仍 保持代謝活性的飼養層細胞，其制備方法如下：

(1)γ射線輻射：取飼養層細胞，吸去培養液，PBS清洗2次， 加入胰蛋白酶，于37℃消化2～10min，細胞脫離皿底時，終止消化， 制成單細胞懸液；將細胞懸液于1500r/min離心3min，棄上清；加入 2mL細胞培養液，用吸管吹打離散成高濃度細胞懸液；將細胞懸液轉 移至20mL無菌血清瓶中，進行γ射線(10-40Gy)照射20-36h；照射 后的細胞懸液經離心后棄上清，即得；或

(2)絲裂霉素C：取飼養層細胞，吸去培養液，加入1-100μg/ml 絲裂霉素C，37℃、5％CO₂培養箱中培養1-5h后，用PBS清洗2次，加 入胰蛋白酶消化3～5min，終止消化；將細胞懸液移入離心管， 1500r/min離心5min，棄上清，向沉淀中加入細胞懸液重復離心1次， 即得。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述標準 培養基包括DMEM培養基、Ham'sF-12培養基、Ham'sF-10培養基、 RPMI1640培養基、Eagle'sBasalMedium、Eagle'sMinimumEssential Medium、HEPES、199培養基、MCDB131培養基、McCoy's5A培養 基、MEF培養基、ES培養基、D-Hank’s培養基，或它們中的兩種或 兩種以上培養基組合。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述標準 培養基中還添加有氨基酸、維生素、無機鹽、腺嘌呤、乙醇胺、葡萄 糖、肝素、皮質醇、胰島素、硫辛酸、酚紅、磷酸乙醇胺、腐胺、丙 酮酸鈉、三碘甲狀腺氨酸、胸苷、轉鐵蛋白、檸檬酸鐵或硫酸亞鐵鹽 中的至少一種；

其中，所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L- 天冬氨酸、L-半胱氨酸或L-左旋谷氨酸中的至少一種；

所述維生素包括維生素H、維生素B6、維生素B2、維生素B1、 維生素B12、氯化膽堿、葉酸、肌醇或煙酰胺中的至少一種；

所述無機鹽包括硫酸銅、硫酸鐵、氯化鉀、氯化鎂、鈉鹽、硒鹽、 硅鹽、鉬鹽、釩鹽、鎳鹽、錫鹽或鋅鹽中的至少一種。