[發明專利]一種快速檢測南方水稻黑條矮縮病毒的膠體金免疫試紙條及其制備方法

有效

• 申請號: 201610096079.1
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105675875B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 吳建祥;周雪平;陳浙
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明所屬的領域為生物技術領域，尤其是涉及一種快速檢測南方水稻黑條矮縮病毒的膠體金免疫試紙條及其制備方法。

背景技術

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)是近年在中國南方稻區新發現的由白背飛虱傳播的一種新水稻病毒，它引起的南方水稻黑條矮縮病在我國造成了巨大的經濟損失。SRBSDV自2001年首次在廣東陽西縣發現后，為害日趨嚴重。90年代以后，雜交水稻種植面積的大幅度增加和吡蟲啉的大范圍高強度施用，使白背飛虱逐漸取代褐飛虱而成為優勢種群，導致近年來我國南方大部分稻區白背飛虱和SRBSDV連年爆發。2008年南方水稻黑條矮縮病毒病擴散至長江流域，2009年該病毒病在我國的發生面積約40萬hm²，晚稻嚴重受害，超過0.67萬hm²水稻基本失收。2010年該病害在我國廣西、廣東、江西、湖南、福建、貴州、云南、浙江、安徽、海南等13個南部省(區)爆發成災。

SRBSDV為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)的一個新種，病毒粒體呈球狀，直徑70-75nm。病毒基因組為雙鏈RNA(dsRNA)，共10個片段，由大到小分別命名為S1-S10，其中S10編碼病毒的外殼蛋白。水稻的各個生育期均可受到SRBSDV侵染，但不同生育期的稻株感病后表現癥狀有所不同：初期感病的稻株明顯矮縮，葉色深綠，上部葉的葉面可見凹凸不平的皺褶，拔節期地上數節節部有氣生須根及高節位分枝，病株莖稈表面有乳白色大 小約1-2mm的瘤狀突起，瘤突呈蠟點狀縱向排列成一短條形，早期乳白色，后期褐黑色，不抽穗或僅抽包頸穗；分蘗期和拔節期感病稻株矮縮不明顯、能抽穗，但穗型小、實粒少、粒重輕。南方水稻黑條矮縮病毒由白背飛虱介體傳毒，病毒可在白背飛虱體內繁殖，白背飛虱一旦獲毒，即終身帶毒，若蟲及成蟲均能傳毒，且白背飛虱高效傳毒，水稻病株上擴繁的二代高齡若蟲可90％帶毒。但該病毒不能經卵傳播，植株間也不互相傳毒。

近年來我國南方水稻黑條矮縮病毒病發生處于上升時期，爆發態勢仍將延續，而簡便、快速、準確的檢測技術對于強化我國南方水稻黑條矮縮病的診斷及其預測預警和科學防控尤為重要。目前一般采用田間觀測、RT-PCR檢測、電鏡觀察和dot-ELISA血清學方法來檢測該病毒，田間觀測準確性低，RT-PCR和電鏡觀察均需要精密儀器和專業的操作人員，只有dot-ELISA血清學方法適用于田間大批量樣品的檢測，但其耗時較長，而膠體金免疫試紙條操作簡單、不用任何儀器、完成樣品檢測僅需5min，檢測結果用肉眼觀察判斷，更適于基層推廣應用。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種快速檢測南方水稻黑條矮縮病毒的膠體金免疫試紙條及其制備方法。

快速檢測南方水稻黑條矮縮病毒的膠體金免疫試紙條的免疫膠體金墊采用吸附有膠體金標記單抗的聚酯膜，所述的單抗由保藏號為CGMCC No.12006的15G6雜交瘤細胞株分泌；硝酸纖維素膜的檢測線即T線上結合有保藏號為CGMCC No.5535的3F1細胞株分泌的單抗，質控線即C線上結合有羊抗鼠IgG。

南方水稻黑條矮縮病毒膠體金免疫試紙條能準確、特異、靈敏地檢測水稻、玉米和白背飛虱體內的南方水稻黑條矮縮病毒，且其檢測水稻病葉的靈敏度達 到1:5,120倍稀釋(w/v,g/mL)，檢測單頭攜毒白背飛虱的靈敏度達到1:51.2倍稀釋(頭/mL)。

南方水稻黑條矮縮病毒膠體金免疫試紙條檢測感染南方水稻黑條矮縮病毒的水稻、玉米和白背飛虱樣品呈強陽性結果，而檢測感染水稻黑條矮縮病毒、水稻齒葉矮縮病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染甘蔗花葉病毒、玉米褪綠斑駁病毒的玉米和健康玉米均呈陰性結果。

快速檢測南方水稻黑條矮縮病毒的膠體金免疫試紙條的制備方法的步驟：

1)南方水稻黑條矮縮病毒單抗的制備：用感染南方水稻黑條矮縮病毒的水稻粗提液為抗原免疫BALB/c小鼠，經細胞融合、篩選、克隆獲得1株能穩定傳代并分泌抗SRBSDV單克隆抗體的雜交瘤細胞株15G6，其保藏號為CGMCC No.12006，該雜交瘤細胞注射入BALB/c小鼠腹腔，制備單抗腹水；

2)膠體金溶液制備：將100mL 0.01％氯金酸加熱沸騰，加入1mL 1％檸檬酸三鈉后混勻，再保持沸騰25min，氯金酸還原成膠體金顆粒溶液；