[發明專利]高效快速抑制狗牙根內源基因表達的方法

有效

• 申請號: 201610092431.4
• 申請日: 2016-02-19
• 公開（公告）號: CN105671052B
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 張兵;劉建秀;史經昂;陳靜波;李丹丹;郭海林;宗俊勤;李建建;汪毅;郭愛桂
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/53;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/6895
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1.一種高效快速抑制狗牙根內源基因表達的方法，其特征在于，所述的狗牙根內源基因cDNA全長序列如序列表的序列2所示，編碼區為序列表中序列2自5’末端第69-1757位核苷酸；

所述的方法包括以下步驟：

(1)狗牙根目的基因片段的克隆：提取狗牙根RNA，逆轉錄成cDNA，通過PCR擴增獲得目的基因序列，測序確認PCR擴增結果正確性，所述克隆擴增的目的基因片段是狗牙根CdPDS基因編碼區456-875核苷酸區段；所述的狗牙根目的基因片段的長度為420bp；

(2)病毒誘導基因沉默載體的構建：將狗牙根目的基因片段和水稻東格魯桿狀病毒基因沉默載體進行酶切、連接、轉化大腸桿菌，獲得連入狗牙根目的基因片段的病毒誘導基因沉默載體，挑取克隆、提取質粒、酶切驗證克隆正確性；

(3)農桿菌浸染狗牙根植株：將連入狗牙根目的基因片段的病毒誘導基因沉默載體轉化農桿菌，將農桿菌擴大培養，使用浸染緩沖液重懸，真空輔助浸染狗牙根植株；

(4)基因表達豐度的分子檢測：提取對照狗牙根植株和農桿菌浸染植株RNA，逆轉錄成cDNA，使用定量PCR檢測目的基因的表達豐度變化，所述農桿菌浸染植株為真空輔助浸染后于28℃、16小時光照/8小時黑暗培養條件下繼續培養21天的狗牙根植株，對照植株為28℃、16小時光照/8小時黑暗培養條件下生長28天的狗牙根植株。

2.權利要求1所述的方法，其步驟(2)所述水稻東格魯桿狀病毒基因沉默載體為pRTBV-MVIGS，酶切用限制性內切酶為MluI和PacI。

3.權利要求1所述的方法，其步驟(3)所述浸染緩沖液配方為10mM嗎啉乙磺酸，10mM氯化鎂，5mM氯化鈣，300mM乙酰丁香酮，pH值為5.6。

4.權利要求1所述的方法，其步驟(3)所述真空輔助浸染狗牙根植株為28℃、16小時光照/8小時黑暗培養條件下生長7天的狗牙根幼苗。

5.權利要求1所述的方法，其步驟(3)所述真空輔助浸染狗牙根植株真空維持時間為5分鐘。