[發明專利]一種用熒光免疫層析法檢測磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201610092183.3
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105717303A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 錢承玉;錢琛;呂作文;劉壯
• 申請（專利權）人: 山東康力醫療器械科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于醫學免疫學領域，涉及一種熒光免疫層析技術，進一步地，本發明涉及一種用稀土熒光免疫層析法檢測磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其試劑盒，以實現快速準確的對磷酯酰肌醇蛋白聚糖3進行定量分析。

背景技術：

原發性肝癌(primaryhepaticcarcinoma，PHC)是目前世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，確診后的五年生存率不足12％，近年來其發病率在世界范圍內有增高趨勢。外科切除仍是目前PHC最常用的治療方法，但大多數患者就診時已屬中晚期，失去了最佳手術治療時機，因而提高PHC的早期診斷水平是提高肝癌治療和預后效果的關鍵。甲胎蛋白(AFP)是目前全世界應用最廣泛的肝癌腫瘤標記物，但PHC患者AFP敏感性僅為35％-65％，特異性不到80％，尤其是早期肝癌陽性率更低，以此作為PHC早期確診的方法并不十分理想，迫切需要尋找新的標記物。磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是近來發現的具有潛在價值的肝癌血清標記物。

GPC3屬于膜性硫酸乙酰肝素類糖蛋白超家族成員，具有羥基末端連接在細胞膜上，氨基端游離在細胞外的特殊結構，被認為與定位，輸送有關。它是由蛋白質、脂類和糖三者共價連接的復雜糖復合物，其氨基端(N)為可溶性蛋白，在肝癌細胞中表達時可分泌至外周血液中，這是外周循環血液中能夠檢測到GPC3的分子生物學基礎。臨床基礎研究顯示，肝細胞發生癌變時GPC3可異常表達，激活的GPC3可通過多種信號傳導通路促進肝細胞惡性轉化，增強其侵襲轉移能力。單一GPC3或AFP在PHC表達有限，而聯合GPC3和AFP檢測顯著提高PHC診斷的敏感性和特異性，分別達84.2％和95.7％，顯著高于AFP或GPC3單獨檢測。能改善PHC診斷水平。尤其是利用GPC3檢測可以提高AFP陰性PHC的診斷水平，對PHC早期診斷和篩查具有一定意義，是提高PHC早期診斷和鑒別診斷水平的有意義的指標。

磷酯酰肌醇蛋白聚糖3檢測方法主要有雙抗夾心法(ELISA)和免疫組化法，ELISA法操作時間長、自動化程度低，定量檢測不夠準確；免疫組化法需要組織切片，而且在PHC早期不能進行組織取樣，無法在早期獲得結果進行早期診斷。因此開發靈敏度更高、快捷方便的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3產品，仍是臨床診斷產品研究領域亟需解決的重要問題。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是針對上述背景技術的不足，利用熒光免疫層析的靈敏性，結合熒光免疫層析分析儀，來提供一種靈敏度高、快捷簡便，可以準確定量的用熒光免疫層析法檢測磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其試劑盒。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案為：一種用熒光免疫層析法檢測磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法，該方法能夠對磷酯酰肌醇蛋白聚糖3進行定量測定，具有靈敏度高、操作簡便快速、適合現場檢測等優點；本發明的另外一個目的是提供一種用熒光免疫層析法檢測磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒，可以應用于各級醫院急診科以及基層醫院。

本發明所述的用熒光免疫層析法檢測磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的試劑盒，其特征在于試劑盒由試紙卡和熒光免疫層析分析儀構成。

所述試紙卡，是在PVC板上順次相互搭接經過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光標記的抗體的結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙，然后切割成4mm寬的試紙條，將試紙條裝入塑料卡內形成試紙卡。

優選地，所述結合墊上吸附有稀土熒光微球，稀土熒光微球的直徑為80-220nm，進一步優選地，所選用的稀土熒光微球的直徑是120-150nm。

優選地，所述稀土熒光微球摻雜有稀土鑭系元素，包括銪(Eu)、釤(Sm)、鉺(Er)、釹(Nd)中的任意一種或幾種。

優選地，所述稀土熒光微球含有稀土絡合物，在基態下穩定，在320-360nm的激發光源作用下，能夠發射出波長范圍在540-580nm的熒光。

所述結合墊上稀土熒光微球標記的抗體為稀土熒光微球標記的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3單克隆抗體，單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗原表位的單克隆抗體細胞株。

進一步優選地，結合墊上稀土熒光微球標記的抗體來源于針對3個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

所述熒光免疫層析分析儀是一種光學檢測系統，用于對檢測結果的定量判定，對磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的檢測范圍為0-800ng/mL。

本發明所述的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3熒光免疫層析檢測試紙盒的制備方法，包括以下步驟：