[發明專利]胸腔積液性質的鑒定方法

在審

• 申請號: 201610091420.4
• 申請日: 2016-02-18
• 公開（公告）號: CN105701364A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 王小中;林晉;王燕;陳鑫;黃波;劉靜
• 申請（專利權）人: 南昌大學第二附屬醫院
• 主分類號: G06F19/20
• 分類號: G06F19/20;G06F19/24
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物醫學，尤其涉及一種胸腔積液性質的鑒定方法。

背景技術

胸腔積液簡稱胸水，是由于全身或局部病變導致胸膜腔內液體形成過快或吸收 過緩而產生的，是胸膜疾病最常見的表現。按照不同疾病來源，可分為炎性、惡性 和結核性三種胸腔積液，其在外觀、成分、脫落細胞學及分子標志物等性質都存在 差異，因此胸腔積液的鑒別對于輔助診治臨床疾病具有重要作用。隨著醫學影像技 術、腫瘤標志物鑒定、免疫學鑒定及酶學鑒定等技術的改進和提高，三種胸腔積液 性質的差異越來越被人們熟知和發現。胸腔積液產生的原因很多也很復雜，因此在 很多情況下，單純的從宏觀表現很難鑒別胸腔積液的性質差異。因此本發明基于高 通量測序技術，從微觀上鑒定三種胸腔積液中細胞外囊泡miRNA的表達差異，為 更好的鑒定胸腔積液性質及臨床診治打下新的基礎。

細胞外囊泡是從細胞表面脫落或者細胞向外分泌釋放的囊狀小泡，直徑大約為 30nm-1000nm，存在于機體幾乎所有的體液中，包括唾液、血液、尿液、胸腔積液 等等。細胞外囊泡包括外泌體、微泡和凋亡小體等。最初囊泡被認為是機體組織和 細胞外排的廢棄物質，其生物學意義在很大程度上被人們忽視。隨著近幾年研究的 深入，囊泡的成分和生物功能也越來越被人們發現和認可。研究表明，微泡中含有 蛋白質、脂類和核酸等機體生物功能成分，包括囊泡來源細胞的蛋白質、酶、mRNA 和miRNA等，并將這些物質通過相應方式轉運至相關靶細胞中，在細胞間信息交 流中發揮作用。研究發現人干細胞來源的微泡可以將人的mRNA轉運到小鼠細胞 中，并導致蛋白的翻譯。同樣，除了mRNA，囊泡也可以將包含的miRNA轉運到 靶細胞中，發揮相應作用。miRNA是一類由內源編碼的長度約為22個核苷酸的非 編碼單鏈RNA分子，在動植物中參與轉錄后基因表達的調控。miRNA本身不具有 編碼蛋白的功能，但研究發現在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著 差異，這就提示miRNA在基因表達的調控中發揮重要作用。最近有研究顯示，細 胞外囊泡中可以高表達miRNA，并通過多種方式影響靶細胞的分化、增殖及免疫 調節等功能。因此，通過高通量測序技術鑒定三種不同性質胸腔積液中細胞外囊泡 miRNA的差異表達，發現特異表達或高表達的miRNA，為胸腔積液的鑒定和臨床 診治提供新的理論基礎，這將會是非常有意義的研究。

發明內容

本發明的目的，就是為了解決上述問題，提供一種新型的胸腔積液性質的鑒定 方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：一種胸腔積液性質的鑒定方 法，包括以下步驟：

A、采用超高速離心的方法提取三種不同疾病來源的胸腔積液標本細胞外囊 泡；

B、利用Trizol法提取標本細胞外囊泡總RNA；

C、構建cDNA測序文庫，主要步驟包括3’端、5’端的連接，第一鏈cDNA的 合成，PCR擴增和片段大小的選擇；

D、使用IlluminaHiseq2500進行高通量測序；

E、對測序所得的序列進行去接頭、去污染處理得到干凈的小RNA分子序列， 然后去除重復序列、mRNA降解片段、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及piRNA， 將剩余的序列與miRNA數據庫中人miRNA序列進行比對分析，獲得三種不同疾 病來源的細胞外囊泡miRNA表達量信息；利用Cufflink軟件分析三種標本的 miRNA表達情況，同時使用BenjiminiandHochberg作為統計學方法，得到三種胸 腔積液中細胞外囊泡miRNA的表達差異；

F、采用超高速離心的方法提取待鑒定胸腔積液細胞外囊泡，采用與上述B、 C、D、E類似的方法得到待鑒定胸腔積液細胞外囊泡miRNA表達量信息，與三 種胸腔積液中細胞外囊泡miRNA的表達差異比對，判斷待鑒定胸腔積液的性質。

所述三種不同疾病來源是指臨床已經確診的肺癌、肺結核和肺炎患者，排除具 有并發癥和已經接受治療的患者；所述胸腔積液的性質包括炎性、惡性和結核性， 炎性對應于肺炎患者的胸腔積液，惡性對應于肺癌患者的胸腔積液，結核性對應于 肺結核患者的胸腔積液。

步驟A中的超高速離心選用Beckman-Coulter公司的L-80XP超高速離心機， 離心轉速為200000g，離心溫度為4℃，離心體積為200ml。