[發明專利]一種延胡索快速鑒別方法有效
申請號: | 201610091330.5 | 申請日: | 2016-02-18 |
公開(公告)號: | CN105624305B | 公開(公告)日: | 2019-06-18 |
發明(設計)人: | 孫冬梅;畢曉黎;羅文匯;胥愛麗;陳昭;陳偉韜;李養學;李素梅;江潔怡;許燦新 | 申請(專利權)人: | 廣東省第二中醫院(廣東省中醫藥工程技術研究院) |
主分類號: | C12Q1/6895 | 分類號: | C12Q1/6895;C12Q1/686 |
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摘要: | |||
搜索關鍵詞: | 一種 延胡索 快速 鑒別方法 | ||
本發明公開了一種延胡索快速鑒別方法,通過針對延胡索的一對特征引物,對延胡索進行快速鑒別,該方法包括以下步驟和條件:(1)將收集的各批供試藥材取總DNA;(2)取特征引物P2,P4加無菌水稀釋;(3)通過PCR反應程序獲得擴增產物;(4)擴增產物與6×Loading buffer混勻后點于瓊脂糖凝膠上,置于紫外燈下觀察,拍照并保存;(5)照片中顯示正品延胡索在200~300bp之間有一條清晰條帶,其他偽品在該位置均無條帶,陰性無干擾。本發明方法屬于快速測定方法,基于PCR技術鑒別延胡索,方法簡單、準確,靈敏度高,取樣量少、穩定性好、檢測速度快、特異性強,非常有利于在制藥過程中延胡索藥材快速質量控制中的應用。
技術領域
本發明涉及中藥質量檢測的技術領域,特別是涉及一種延胡索快速鑒別方法。
背景技術
延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖,為著名的“浙八味”之一,具有活血,行氣,止痛的功效。由于臨床用量不斷增加,國內外市場需求量持續加大,導致偽劣混雜,不法商人以次充好,以假冒真。
延胡索偽品來源多為其同屬植物,成分有相似,其中全葉延胡索為最常見的代替品和原材料市場上的混淆品。僅僅靠傳統的形態分析已不能進行品種的科學鑒定和種源的遺傳分析,并且檢驗時間長,檢驗成本較高,沒有一種可靠有效快速方法可將延胡索與其他偽品區分開來。
發明內容
本發明的目的在于提供延胡索快速鑒別方法,該方法利用特征引物通過PCR技術對延胡索進行快速鑒別,解決制藥過程中延胡索藥材快速質量控制的問題。
本發明具體的技術方案如下:
一種延胡索快速鑒別方法,包括如下步驟:延胡索快速鑒別方法,其特征在于,通過針對延胡索的一對特征引物的聚合酶鏈式反應,對延胡索進行快速鑒別,該方法包括以下步驟和條件:
(1)將各批供試藥材,經95%乙醇擦拭表面,晾干,用液氮冷凍研磨成粉末,取研碎后的粉末60mg,用DNeasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒提取試劑盒提取總DNA,備用;
(2)取特征引物P2 5'-CTGTGGCCCTCCGGGTTT-3',P4 5'-GAGTCGCCCCCATCCCTCTAC-3'加無菌水稀釋成10μmol/μL,備用;
(3)PCR擴增:50μl體系中含有濃度為10μmol的P2、P4上下游引物各1μL,模版DNA2μL,Prime STAR HS(Premix)聚合酶預混體系25μL,剩余體積用無菌蒸餾水補足;
PCR反應程序為:94℃預變性2min;94℃變性10s,68℃退火5s,72℃延伸30s,30個循環;72℃延伸5min;獲得擴增產物;
(4)取步驟(3)擴增產物5μL,與6×Loading buffer 1.0μL混勻后點于1.5%瓊脂糖凝膠上,用1×TAE電泳緩沖液在110V電壓恒壓電泳20min;
取出凝膠,置于紫外燈下觀察,并用CAMAG成像系統拍照并保存;
(5)步驟(4)所得照片中顯示,正品延胡索在200~300bp之間有一條清晰條帶,其他偽品在該位置均無條帶,陰性無干擾;
(6)對步驟(1)~(5)進行耐用性考察:分別考察DNA聚合酶、PCR儀對該延胡索快速鑒別方法的影響,分別更換DNA聚合酶為Taq聚合酶,更換PCR儀為熒光定量PCR儀。
本發明具有如下優點及用途,本發明延胡索快速鑒別方法能夠簡單、準確、直接地鑒別延胡索,只需微量的用量即可檢測,并具有靈敏度高,穩定性好,特異性強的特點,用于制藥過程中延胡索藥材快速質量控制。
下面結合附圖與具體實施方式,對本發明進一步詳細說明。
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