[發明專利]測定蛋白質的唾液酸含量的方法

有效

• 申請號: 201610091196.9
• 申請日: 2016-02-18
• 公開（公告）號: CN107091885B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 董思聰;馬梵辛;王學海;許勇;李莉娥;黃璐
• 申請（專利權）人: 湖北生物醫藥產業技術研究院有限公司;人福醫藥集團股份公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明提出了一種測定蛋白質的唾液酸含量的方法，該方法包括：(1)利用唾液酸酶對蛋白質樣品進行消化處理，以便獲得含有唾液酸的消化液；(2)對所述消化液進行沉淀處理，并分離含有所述唾液酸的上清液；(3)通過超高效液相色譜?質譜法對所述上清進行分析，以便獲得質譜圖；以及(4)基于所述質譜圖，確定所述蛋白質的唾液酸含量。本發明實施例所提出的方法，在無需對唾液酸進行衍生化的條件下，對蛋白樣品中的總唾液酸含量進行快速定量檢測，方法操作簡單，靈敏度高，準確度高，耗時短，可以用于生物大分子生產的中間質量控制或者最終產品的質量檢驗。

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，具體地，本發明涉及測定蛋白質的唾液酸含量的方法。

背景技術

唾液酸是一類骨架為9個碳原子的，神經氨酸的單糖衍生物。最為常見的唾液酸為N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)，廣泛分布于動物組織中，主要以糖蛋白和神經節苷脂的形式存在。唾液酸在生物體內發揮多種功能，包括促進大腦發育，增強記憶力，促進腸道對維生素和礦物質的吸收等。同時，由于唾液酸帶負電，在細胞上形成相對集中的負電區域，也是流感等病毒的結合受體。

近年來，以單克隆抗體和重組蛋白為代表的生物大分子在醫藥領域發展迅速，多種大分子藥物成為重磅炸彈，全球年銷售額超過數十億美元的規模。此類生物大分子藥物多由哺乳動物細胞系表達，具有豐富的糖基化修飾，包括唾液酸修飾。由于唾液酸帶有較強的負電，會影響蛋白大分子在體內的半衰期，影響大分子藥物在體內的藥代動力學。因此，唾液酸程度往往是生物大分子藥物的關鍵質量屬性之一，在生物大分子藥物的開發和生產過程中占據非常重要的地位。

然而，測定單克隆抗體和重組蛋白類生物大分子藥物中唾液酸含量的方法仍有待進一步開發。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明提出了一種操作簡單，靈敏度高，耗時短，可以用于生物大分子生產的中間質量控制或者最終產品的質量檢驗的測定唾液酸含量的方法。

在本發明的第一方面，本發明提出了一種測定蛋白質的唾液酸含量的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：(1)利用唾液酸酶對蛋白質樣品進行消化處理，以便獲得含有唾液酸的消化液；(2)對所述消化液進行沉淀處理，并分離含有所述唾液酸的上清液；(3)通過超高效液相色譜-質譜法對所述上清進行分析，以便獲得質譜圖；以及(4)基于所述質譜圖，確定所述蛋白質的唾液酸含量。現有的利用高效液相色譜或氣相色譜法測定蛋白樣品中的唾液酸含量的方法，由于唾液酸本身沒有紫外吸收，故高效液相色譜或氣相色譜法均需要對蛋白樣品進行前處理，只有衍生化后的唾液酸才能被檢測到，所以整個過程操作復雜，耗時較長；而現有的利用分光光度法測定蛋白樣品中的唾液酸含量的方法，檢測限和定量限較高。本發明實施例所提出的方法，相比于現有技術，在無需對唾液酸進行衍生化的條件下，對蛋白樣品中的總唾液酸含量進行快速定量檢測，方法操作簡單，靈敏度高，準確度高，耗時短，可以用于生物大分子生產的中間質量控制或者最終產品的質量檢驗。

根據本發明的實施例，上述測定蛋白質的唾液酸含量的方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述質譜采用下列條件：負離子掃描模式，離子源溫度為150℃，毛細管電壓為2.5kV，錐孔電壓為12V，脫溶劑溫度為450℃，碰撞能量為18eV，離子采集方式為多反應檢測模式，采集離子為母離子308.7，子離子87.02。根據本發明的實施例，在上述質譜條件下，所得唾液酸的質譜圖峰形好、峰分離度好，檢測靈敏度高、準確度高。