[發明專利]釀酒酵母染色體的轉移方法

有效

• 申請號: 201610090212.2
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105602934B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 元英進;謝澤雄;吳毅;李炳志
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/04
• 分類號: C12N15/04;C12Q1/04;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及微生物領域，特別涉及釀酒酵母染色體的轉移方法。本發明利用endoreduplication backcross方法將合成型V號染色體釀酒酵母菌株和合成型X號釀酒酵母菌株融合為二倍體菌株，利用半乳糖誘導丟失野生型V號染色體和X號染色體并利用SC+5?FOA培養基進行篩選；通過孢子拆分獲得攜帶合成型V號和X號染色體的釀酒酵母單倍體菌株。本發明對比已有成果具有以下有益效果：快速實現釀酒酵母染色體的轉移；避免姐妹染色單體的交叉互換，獲得染色體轉移后的釀酒酵母單倍體菌株。

技術領域

本發明涉及微生物領域，特別涉及釀酒酵母染色體的轉移方法。

背景技術

生物基因組攜帶了決定生物基本性狀的遺傳信息，人工DNA合成技術和DNA大片段操作技術推動了基因組人工合成研究的進步。合成生物學的發展推動了通過人工設計合成來“寫”基因組信息標志著“人造生命”的開始。

近年來，丙型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒、X174噬菌體、T7噬菌體、水稻(Oryzasativa)葉綠體和小鼠(Mus musculus)線粒體等基因組序列先后實現了人工改造與合成,尤其是活性人工基因組設計與合成的成功使人工基因組合成工作受到了世界的極大關注,即支原體基因組和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體的合成。Venter研究組開發了體外組裝和酵母體內組裝相結合的方式進行基因組合成，于2008年實現了生殖支原體(Mycoplama genitalium)基因組的全化學人工合成,然后利用基因組轉移的技術于2010年將人工合成的蕈狀支原體(Mycoplasma mycoides)基因組轉入移除自身染色體的山羊(Capra aegagrus hircus)支原體(Mycoplasma capriolum)細胞中,得到了能夠發揮正常功能的全新的支原體細胞。2011年,Boeke研究組分別對釀酒酵母Ⅵ號染色體左臂和Ⅸ號染色體右臂進行了人工設計,并于2014年成功合成了具有生物學活性的完整Ⅲ號人工染色體,標志著基因組人工合成工作進入真核生物領域。

基因組DNA長度過大，而且絕大多數真核生物具有多條染色體，因此在完成生物染色體合成后如何的進行完整轉移成為基因組合成的一個需要解決的問題。在釀酒酵母中，通常通過將改造后的菌株與相反交配型的釀酒酵母細胞進行融合，獲得二倍體釀酒酵母菌株，然后通過生孢、孢子拆分的方法獲得全新的單倍體。然而釀酒酵母細胞在進行減數分裂時，姐妹染色單體之間有可能發生交叉互換，因此不能完全保證獲得的全新單倍體細胞中目標染色體的正確性。

發明內容

有鑒于此，本發明提供釀酒酵母染色體的轉移方法。本發明提供全新的釀酒酵母染色體轉移技術，避免了姐妹染色單體交叉互換對染色體的影響，確保染色體完整的進行轉移，獲得染色體轉移后的釀酒酵母單倍體菌株。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了釀酒酵母染色體的轉移方法，包括如下步驟：

步驟1：將待轉移染色體對應于相反交配型細胞中的染色體進行改造，在著絲粒前添加GAL1啟動子；

步驟2：將待轉移染色體的酵母菌株與改造后的酵母菌株進行融合，構建二倍體釀酒酵母菌株；

步驟3：利用半乳糖(Galactose)誘導丟失添加GAL1啟動子的染色體，并利用SC+5-FOA培養基進行篩選；

步驟4：通過生孢和孢子拆分，獲得染色體轉移后的釀酒酵母單倍體菌株。

在本發明的一些具體實施方案中，所述轉移方法中所述染色體為V號染色體和X號染色體。

在本發明的一些具體實施方案中，所述轉移方法中步驟2之前還包括在著絲粒前添加營養篩選標記。

在本發明的一些具體實施方案中，所述轉移方法中所述營養篩選標記為Kl.URA3。