[發明專利]猴STLV1病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610089080.1
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105647917A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 李丹丹;徐義剛;高慎陽;王昱
• 申請（專利權）人: 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/52
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技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的檢測方法及抗原技術領域，具體涉及一種猴 STLV1病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

背景技術

猴T淋巴細胞趨向性病毒1型(SimianTlymphotropicvirustypel， STLV1)是猴群中一種重要的傳染性病毒，該病毒主要侵害猴的免疫系統，引起免疫器官的 病變或免疫機能紊亂，從而影響動物實驗的研究。早在1992年，中華人民共和國衛生部頒布 的《醫學實驗動物標準》就規定了，STLV1型是SPF實驗猴必須排除的病毒之一。李紹東等 對我國恒河猴的STLV1流行病學特征進行調查發現，我國野生和飼養恒河猴血清中廣泛 存在STLV1抗體。

饒軍華等對華南地區一個大型靈長類繁育中心恒河猴、食蟹猴猴群近3年的STLV1 感染狀況的檢測結果也證實這一觀點，并且發現猴群STLV1的平均感染率為4.97%，食 蟹猴比恒河猴更容易感染STLV1。隨著當前國際市場對SPF實驗猴需求量的增加，STLV1 病毒已被列為必須排除的病原之一。目前國內外有幾種檢測STLV1的方法，如國家標準規 定的免疫熒光(IFA)檢測方法，但該方法操作復雜，而且對設備的要求苛刻，不適合大樣本 的檢測；國外已研制出STLV1型商品化ELISA抗體檢測試劑盒(美國BioReliance公 司)，雖然準確率較高，但價格非常昂貴且僅限于實驗室使用。實際上，STLV1檢測技術已經 在某種程度上成為制約我國實驗猴SPF種群建立的技術瓶頸之一。因此建立一種快速、準 確檢測STLV1抗體的方法，并研制出操作簡單、準確率高、價格低廉的試劑盒，對推動國內 實驗猴SPF種群的建立，進一步提升我國實驗猴的國際競爭力具有重大意義。

免疫梳方法是能夠對病毒血清抗體進行定性、定量檢測的一項新型體外診斷技 術，這種技術突破性地將病毒抗原點布在具有極強蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好 的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強度和硬度，經機器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀 釋好的待檢血清樣本時，特異性抗體與抗原結合并固著于膜上，再通過酶標二抗底物反應， 染色后，抗體陽性的樣本表現為肉眼可見的紅色斑點，陰性則無顏色變化。膜經過圖像處理 系統數據化后可以進行定量分析。

發明內容

本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種猴STLV1 病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

本發明是通過以下的技術方案實現的：

1、一種用于構建猴STLV1病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，引物STLV1F：如序列表 SeqNo.1所示，引物STLV1R：如序列表SeqNo.2所示。

2、一種用于制備猴STLV1病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-STLV1，序 列如序列表SeqNo.3所示。

3、一種用于制備猴STLV1病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-STLV1的構 建方法，包括如下步驟：

（1）根據猴STLV1病毒的基因序列，設計SOE-PCR擴增引物，引物STLV1F：如序列表Seq No.1所示，引物STLV1R：如序列表SeqNo.2所示；

（2）進行SOE-PCR擴增猴STLV1病毒基因；

（3）猴STLV1病毒基因的回收；

（4）克隆質粒pMD18T-STLV1的構建及測序；

（5）表達載體pGEX-4T-STLV1的構建，序列如序列表SeqNo.3所示。

4、如上所述的一種用于制備猴STLV1病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T- STLV1的構建方法，所述的步驟（2）采用SOE-PCR反應的具體步驟如下：

將混合液在95℃預變性5min，94℃變性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30 個循環，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：