[發(fā)明專利]猴MeV病毒抗體的免疫梳檢測(cè)試紙及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610089078.4
• 申請(qǐng)日: 2016-02-17
• 公開（公告）號(hào): CN105647916A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李丹丹;徐義剛;高慎陽;王昱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/52
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法及抗原技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及猴MeV病毒 抗體的免疫梳檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

麻疹是由麻疹病毒(Measlesvirus,MeV)引起的一種人等靈長目動(dòng)物急性傳染 病，是猴場(chǎng)須嚴(yán)格控制的疾病之一。一旦爆發(fā)，其蔓延速度快，而且難以控制。麻疹病毒是一 種穩(wěn)定的單型病毒，難以徹底清除，從而干擾實(shí)驗(yàn)研究。近年來，我國實(shí)驗(yàn)猴飼養(yǎng)量快速發(fā) 展，總數(shù)在二十萬以上，實(shí)驗(yàn)猴的進(jìn)出口貿(mào)易量在逐年增加。隨著國際市場(chǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)猴質(zhì)量的 要求不斷提高，麻疹病毒己成為大多數(shù)進(jìn)口國要求的必檢項(xiàng)目。

免疫梳方法是能夠?qū)Σ《狙蹇贵w進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的一項(xiàng)新型體外診斷技 術(shù)，這種技術(shù)突破性地將病毒抗原點(diǎn)布在具有極強(qiáng)蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好 的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強(qiáng)度和硬度，經(jīng)機(jī)器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀 釋好的待檢血清樣本時(shí)，特異性抗體與抗原結(jié)合并固著于膜上，再通過酶標(biāo)二抗底物反應(yīng)， 染色后，抗體陽性的樣本表現(xiàn)為肉眼可見的紅色斑點(diǎn)，陰性則無顏色變化。膜經(jīng)過圖像處理 系統(tǒng)數(shù)據(jù)化后可以進(jìn)行定量分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服當(dāng)前技術(shù)在推廣使用中存在的缺陷，提供一種猴MeV病 毒抗體快速檢測(cè)免疫梳的制備方法。

本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

1、一種用于構(gòu)建猴MeV病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，引物MeVF：如序列表Seq No.1所示，引物MeVR1：如序列表SeqNo.2所示，引物MeVR2：如序列表SeqNo.3所示。

2、一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體pGEX-4T-MeV，序列如序 列表SeqNo.4所示。

3、一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體pGEX-4T-MeV的構(gòu)建方 法，包括如下步驟：

（1）根據(jù)猴MeV病毒的基因序列，設(shè)計(jì)SOE-PCR擴(kuò)增引物，引物MeVF：如序列表SeqNo.1 所示，引物MeVR1：如序列表SeqNo.2所示，引物MeVR2：如序列表SeqNo.3所示；

（2）進(jìn)行SOE-PCR擴(kuò)增猴MeV病毒基因；

（3）猴MeV病毒基因的回收；

（4）克隆質(zhì)粒pMD18T-MeV的構(gòu)建及測(cè)序；

（5）表達(dá)載體pGEX-4T-MeV的構(gòu)建，序列如序列表SeqNo.4所示。

4、如上所述的一種用于制備猴MeV病毒抗體的免疫梳的重組表達(dá)載體pGEX-4T- MeV的構(gòu)建方法，所述的步驟（2）采用SOE-PCR反應(yīng)的具體步驟如下：

第一輪PCR反應(yīng)條件：

將混合液在95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，15 個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：

MeVF引物 1 μL MeVR引物 0.5 μL 2×Taq MasterMix 15 μL 超純水 補(bǔ)足至30 μL

第二輪PCR反應(yīng)條件：

將混合液在95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30 個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：