[發明專利]猴B病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610089045.X
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105647915A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 李丹丹;高慎陽;徐義剛;邱索平
• 申請（專利權）人: 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的檢測方法及抗原技術領域，具體涉及一種猴B病 毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

背景技術

猴B病毒也稱為猴皰疹病毒(Herpesvirussimian)，是一種人畜共患病原，自然宿 主是獼猴。猴感染B病毒后只引起局部或無癥狀感染，類似于人感染單純皰疹病毒，而人感 染后則會導致腦炎、腦脊髓炎，嚴重時致呼吸麻痹死亡。對實驗室工作人員的調查表明，至 今已有43例人感染B病毒的報道，雖然數目不高，但死亡率大于70%，幸存者會留下神經后遺 癥。2002年頒布實施的國家標準，已將B病毒列入普通級實驗用猴應排除的病原微生物。在 我國，猴子資源豐富，流動性較強。每年不僅有一定數量的獼猴、食蟹猴等出口歐美地區，而 且也從東南亞地區進口一定數量的猴子，因此對進出口猴子B病毒的檢測，一直是檢驗檢疫 工作的重要任務之一。目前針對B病毒的檢測方法主要有病原分離、分子生物學檢測方法和 血清學檢測。在病原學檢測方面：由于B病毒是生物安全四級病原微生物，其培養需在生物 安全四級實驗室進行，因此病原分離檢測僅在國家規定的特定實驗室進行。在分子生物學 檢測方面，雖然PCR方法可用于猴群的質量監測，但多數情況下不能檢出病毒核酸的存在， 原因是B病毒像其他α皰疹病毒一樣，感染后會在宿主神經節建立潛伏感染并很少活化。所 以抗體檢測是判斷猴是否感染B病毒的重要依據。

免疫梳方法是能夠對病毒血清抗體進行定性、定量檢測的一項新型體外診斷技 術，這種技術突破性地將病毒抗原點布在具有極強蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好 的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強度和硬度，經機器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀 釋好的待檢血清樣本時，特異性抗體與抗原結合并固著于膜上，再通過酶標二抗底物反應， 染色后，抗體陽性的樣本表現為肉眼可見的紅色斑點，陰性則無顏色變化。膜經過圖像處理 系統數據化后可以進行定量分析。

發明內容

本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種猴B病毒 抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

本發明是通過以下的技術方案實現的：

1、一種用于構建猴B病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，引物BVF：如序列表SeqNo.1 所示，引物BVR1：如序列表SeqNo.2所示，引物BVR2：如序列表SeqNo.3所示。

2、一種用于制備猴B病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-BV，序列如序列 表SeqNo.4所示。

3、一種用于制備猴B病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-BV的構建方法， 包括如下步驟：

（1）根據猴B病毒的基因序列，設計SOE-PCR擴增引物，引物BVF：如序列表SeqNo.1所 示，引物BVR1：如序列表SeqNo.2所示，引物BVR2：如序列表SeqNo.3所示；

（2）進行SOE-PCR擴增猴B病毒基因；

（3）猴B病毒基因的回收；

（4）克隆質粒pMD18T-BV的構建及測序；

（5）表達載體pGEX-4T-BV的構建，序列如序列表SeqNo.4所示。

4、如上所述的一種用于制備猴B病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-BV的 構建方法，所述的步驟（2）采用SOE-PCR反應的具體步驟如下：

第一輪PCR反應條件：

將混合液在95℃預變性5min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，15 個循環，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：