[發明專利]猴SRV1病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610089044.5
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105647914A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 李丹丹;高慎陽;徐義剛;邱索平
• 申請（專利權）人: 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/531
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技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的檢測方法及抗原技術領域，具體涉及一種猴SRV1 病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

背景技術

猴D型反轉錄病毒(simiantype-Dretrovirus，SRV)屬反轉錄病毒科、D型反轉錄 病毒屬，與猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus,SIV)同為猴獲得性免疫缺 陷綜合征(SAIDS)的一種致病病毒。目前已發現的SRV有5個血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主 要的靶細胞是淋巴細胞，感染后可造成淋巴細胞耗竭，誘發免疫缺陷。各型SRV的發生有其 種屬性和群體性，一旦傳入易感猴群，可使80%以上的猴發病致死。SRV自然宿主是獼猴，而 我國是世界上獼猴的一個主要分布區，遍及東南各省，尤其是海南、云南、廣西、四川、貴州 和福建等省區，每年都有一定數量的獼猴出口歐美地區，同時也從東南亞地區進口一定數 量的獼猴。自美國從中國進口的猴子中分離到SRV-5病毒以來，我國也開始了對國內獼猴 SRV的檢測。SRV感染的診斷除了檢查臨床癥狀，還要結合實驗室診斷方法，常用的實驗室診 斷方法有聚合酶鏈式反應（PCR）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光（IFA）、免疫印 跡（WesternBlot）、病毒分離等。

免疫梳方法是能夠對病毒血清抗體進行定性、定量檢測的一項新型體外診斷技 術，這種技術突破性地將病毒抗原點布在具有極強蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好 的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強度和硬度，經機器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀 釋好的待檢血清樣本時，特異性抗體與抗原結合并固著于膜上，再通過酶標二抗底物反應， 染色后，抗體陽性的樣本表現為肉眼可見的紅色斑點，陰性則無顏色變化。膜經過圖像處理 系統數據化后可以進行定量分析。

發明內容

本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種猴SRV1病 毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

本發明是通過以下的技術方案實現的：

1、一種用于構建猴SRV1病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，引物SRV1F：如序列表Seq No.1所示，引物SRV1R：如序列表SeqNo.2所示。

2、一種用于制備猴SRV1病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-SRV1，序列 如序列表SeqNo.3所示。

3、一種用于制備猴SRV1病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-SRV1的構建 方法，包括如下步驟：

（1）根據猴SRV1病毒的基因序列，設計SOE-PCR擴增引物，引物SRV1F：如序列表Seq No.1所示，引物SRV1R：如序列表SeqNo.2所示；

（2）進行SOE-PCR擴增猴SRV1病毒基因；

（3）猴SRV1病毒基因的回收；

（4）克隆質粒pMD18T-SRV1的構建及測序；

（5）表達載體pGEX-4T-SRV1的構建，序列如序列表SeqNo.3所示。

4、如上所述的一種用于制備猴SRV1病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T- SRV1的構建方法，所述的步驟（2）采用SOE-PCR反應的具體步驟如下：

將混合液在95℃預變性5min，94℃變性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30 個循環，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：