[發明專利]BCR/ABL基因融合與ASS基因缺失檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201610088093.7
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN107083419B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 朱蓉;吳詩揚;廖傳榮
• 申請（專利權）人: 益善生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

本發明公開了一種BCR/ABL基因融合與ASS基因缺失檢測試劑盒，該試劑盒包括有染料標記的，針對ASS和ABL基因序列的第一組探針，針對BCR基因M?BCR斷裂位點上游基因序列的第二組探針，兩組探針標記的染料的顏色都不同；所述兩組探針為分別以人基因組DNA為模板，通過引物擴增得到的擴增產物。本發明FISH探針的長度是發明人經過大量實驗，對實驗結果進行比對和統計分析后得出的最優長度，能達到檢測特異性和雜交時長之間的最優平衡，既能保證結果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時間，使得檢測能在7?8個小時內完成，提高了檢測效率。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種BCR/ABL基因融合與ASS基因缺失檢測試劑盒。

背景技術

慢性粒細胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)是一種發生于造血干細胞的血液系統惡性克隆增生性疾病。在受累的細胞系中可找到費城染色體(Ph)或(和)BCR/ABL基因重排。由于t(9；22)(q34；q11.2)而產生的費城染色體或(和)BCR/ABL基因重排在血液腫瘤中具有重要的診斷和預后意義，出現于90％以上的CML、30％的成人急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)、2％-10％的兒童ALL、以及少數的急性粒細胞白血病(Acute Myelogenous Leukemia，AML)和多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者。

位于22q11的BCR基因與位于9q34的ABL基因相互易位，形成BCR/ABL融合基因。BCR基因共23個外顯子，主要有兩種斷裂熱點：在CML中幾乎都為M-BCR位點(跨越外顯子12-16的58kb區域)，而在ALL中大約2/3為m-BCR位點(第一內含子的55kb區域)。ABL基因有1b、1a和2～11共12個外顯子，上游與ASS基因相連，其斷裂位于第1或第2內含子。因斷裂點不一，BCR/ABL融合基因及其mRNA和蛋白產物呈多樣，不同的融合產物與疾病的類型和疾病的進展相關，且具有不同的致癌能力。BCR/ABL融合基因是一種抗細胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，激活多種信號傳導途徑，抑制細胞凋亡，使細胞過度增殖而使細胞調控發生紊亂。具有BCR/ABL融合基因的患者預后差，臨床上可以根據患者是否存在BCR/ABL融合基因來選擇性地使用分子靶向治療藥物。大約10-30％的患者在衍生的9號染色體上ABL/BCR融合基因出現部分或完全缺失，缺失區域位于ABL與BCR基因融合之處，可長達幾MB，典型體現為包括ASS基因所在的區域。臨床發現此區域出現缺失的患者意味著更短的無病生存期和總生存期，治療效果及預后更差。因此，對BCR/ABL融合基因檢測，能更好地指導患者分子靶向治療及預后判斷。

目前，常規的BCR/ABL融合基因檢測方法主要包括以下3種：細胞遺傳學檢測、基于PCR方法的檢測和FISH檢測。細胞遺傳學檢測需培養細胞，耗時較長，只能檢測中期的細胞，且成功率和靈敏度低，無法對Ph陰性但存在BCR/ABL融合基因的患者做出診斷和預后；基于PCR的檢測如RT-PCR、Q-PCR等易污染，假陽性率高，且只能檢測已知的斷裂點，對未知或含少量轉錄本的BCR/ABL融合基因無法檢出。FISH檢測對病人外周血或骨髓的BCR/ABL融合基因具有極高的靈敏度和檢測隱匿型易位的能力，其假陽性率遠遠低于PCR檢測，能提供相對于核型分析更為可靠的分子遺傳學證據，可用于預后判斷、用藥療效、微小病灶殘留及移植術后效果的監測。雖然目前FISH檢測方法得到了廣泛的應用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)使用人工染色體制備的檢測探針中存在較多的重復序列，影響雜交的特異性，同時造成較高的背景熒光；(2)檢測步驟繁雜，探針序列過長，探針與樣本雜交往往需要12-16h才能保證充分雜交，費時費力；(3)一些優化的探針序列過短，導致檢測特異性降低且信號微弱難以被檢測。因此，急需一種FISH檢測方法，其探針不含重復序列、長度適宜，既能保證雜交反應的特異性和最佳的熒光檢測強度，又能最大限度縮短FISH檢測時長，提高檢測特異性和檢測效率。

發明內容