[發明專利]烏塌菜總RNA的高效提取方法

在審

• 申請號: 201610087704.6
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105543215A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 汪承剛;方柔;劉思嘉;陳國戶;袁凌云;朱世東;葛繼濤
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 劉向輝;王凝

1.烏塌菜總RNA的高效提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取烏塌菜葉片加入液氮快速研磨成粉末，倒入離心管中；

2)向上述粉末中加入Trizol裂解液，將離心管置于旋窩機中震蕩 后室溫靜置，然后4℃離心；

3)將上清液置于另一離心管中，向上清液中加氯仿，震蕩后室 溫靜置，然后4℃離心；

4)將上清液轉移至另一離心管中，加異丙醇上下顛倒搖勻，-20 ℃靜置后，4℃離心；

5)棄去上清液，用不同濃度的乙醇洗RNA沉淀，4℃離心，棄去 上清液，RNA置于超凈工作臺室溫干燥后，用不含RNA酶的滅菌水 溶解，-80℃保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)具體為： 取烏塌菜葉片0.1mg，剪碎后，分2-3次加入15-20mL液氮，在3-5min 內將葉片研磨成粉末，操作在超凈工作臺上完成。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)具體為： 向步驟1)的粉末中加入1-1.5mLTrizol裂解液，將離心管置于旋窩機 中震蕩后室溫靜置3-5min，然后4℃，12000rpm離心3-5min。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)具體為： 將步驟2)所得上清液置于另一離心管中，向上清液中加0.15-0.3mL 氯仿，蓋緊離心管，用手搖蕩15-30s后，室溫靜置3-5min，然后4℃， 13000rpm離心5-15min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)具體為： 將步驟3)所得上清液轉移至另一離心管中，加等體積的4℃異丙醇， 上下顛倒搖勻，-20℃靜置3-5min，然后4℃，13000rpm離心5-15min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)具體為： 棄去上清液，RNA沉淀用0.5-1.0mL75％乙醇沖洗2次，然后4℃，13000 rpm離心3-5min；棄去上清液，RNA沉淀再用0.5-1.5mL無水乙醇沖 洗1次，然后4℃，13000rpm離心3-5min；去除乙醇，RNA置于超凈 工作臺室溫干燥5-10min，然后用不含RNA酶的滅菌水80-100μL溶 解，-80℃保存。

7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，包括以下 步驟：

1)取烏塌菜葉片0.1mg，剪碎后，分2-3次加入20mL液氮，在3 min內將葉片研磨成粉末，倒入離心管中，操作在超凈工作臺上完成；

2)向上述粉末中加入1mLTrizol裂解液，將離心管置于旋窩機中 震蕩后室溫靜置3min，然后4℃，12000rpm離心5min；

3)將上清液置于另一離心管中，向上清液中加0.2mL氯仿，蓋 緊離心管，用手搖蕩20s后，室溫靜置5min，然后4℃，13000rpm離 心10min；

4)將上清液轉移至另一離心管中，加等體積的4℃異丙醇，上下 顛倒搖勻，-20℃靜置5min，然后4℃，13000rpm離心10min；

5)棄去上清液，RNA沉淀用0.8mL75％乙醇沖洗2次，然后4℃， 13000rpm離心5min；棄去上清液，RNA沉淀再用1.0mL無水乙醇沖 洗1次，然后4℃，13000rpm離心5min；去除乙醇，RNA置于超凈工 作臺室溫干燥3-5min，然后用不含RNA酶的滅菌水80μL溶解，-80 ℃保存。