[發(fā)明專利]三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610086754.2
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105651992B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金茂俊;王靜;杜鵬飛;金芬;邵華;佘永新;鄭鷺飛;王珊珊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 欒波

1.一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括盒體，所述盒體內(nèi)包含有：

三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品、三唑磷磁性納米探針、單標(biāo)膠體金納米探針、三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針、DNA生物芯片、銀染試劑；

所述三唑磷磁性納米探針由磁性納米粒子和三唑磷完全抗原偶聯(lián)而成；所述三唑磷完全抗原由三唑磷和載體蛋白偶聯(lián)而成；

所述載體蛋白為雞卵白蛋白；所述磁性納米粒子的粒徑為18～22nm；

所述單標(biāo)膠體金納米探針由單鏈DNA1包被膠體金顆粒得到；

所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針由抗三唑磷抗體和雙鏈DNA包被膠體金顆粒得到；

所述DNA生物芯片由單鏈DNA2點制得到；

所述雙鏈DNA由硫醇修飾的單鏈DNA和條形碼單鏈DNA互補配對而成；所述單鏈DNA1和單鏈DNA2與所述條形碼單鏈DNA存在互補配對關(guān)系，且配對區(qū)域不重疊；

所述膠體金顆粒的粒徑為13～15nm；

所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針具體由以下方法制備得到：

1)、取膠體金溶液調(diào)pH至8.8～9.2后向其中加入抗三唑磷抗體，攪拌混合，靜置25～35min；然后加入硫醇修飾的單鏈DNA鏈，8～12℃靜置36～44h；再調(diào)整pH至7.3～7.5，加入NaCl至濃度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min離心8～12min，棄上清，得到含寡核苷酸的膠體金；

2)、用牛血清白蛋白濃度為0.8～1.2％的磷酸鹽緩沖溶液重懸所述含寡核苷酸的膠體金，孵育1～3h；再加入與所述硫醇修飾的單鏈DNA鏈互補的生物條形碼DNA鏈，室溫雜交3～5h，8000～11000r/min離心，棄上清，得到所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針；

所述步驟1)中在加入NaCl至既定濃度時，在120～180min內(nèi)分2～4次等量加入，每次間隔40～60min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述抗三唑磷抗體為單克隆抗體。

3.權(quán)利要求1或2所述的三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒在三唑磷定性定量分析中的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求1或2所述的三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒測定三唑磷的方法，其特征在于，包括：

a)、將三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品、提取與凈化后的待測樣品分別與等體積的三唑磷雙標(biāo)膠體金探針和三唑磷磁性納米探針混合孵育；

b)、洗滌孵育產(chǎn)物并去雜化得到與各標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品對應(yīng)的生物條形碼；

c)、將所述生物條形碼與DNA生物芯片雜交，并加入單標(biāo)納米金探針放大信號；雜交反應(yīng)結(jié)束后加入銀染試劑并用芯片掃描儀測定各孔灰度值；

d)、以三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度所對應(yīng)的灰度抑制率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的三唑磷濃度。