[發明專利]一種酯酶及其應用

有效

• 申請號: 201610086094.8
• 申請日: 2016-02-15
• 公開（公告）號: CN105602968B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 蔡宇杰;張強;鄧華祥;陳佳君;白亞軍;鄭曉暉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/18
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明涉及獲得的一種酯酶基因及其克隆表達與應用，屬于生物工程領域。公開了其底物特性。該酯酶具有廣泛的作用，具有重要的工業應用價值。

技術領域

本發明克隆表達了一種酯酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。

背景技術

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterases，FAEs)又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，是能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放游離阿魏酸的酶。它能切斷細胞壁中多糖-多糖、多糖-木質素間的交聯，有利于細胞壁物質中多糖的降解和木質素的釋放，因此在食品、飼料和造紙工業具有廣闊的應用前景。在食品工業中，利用酯酶來降解植物細胞壁中的阿魏酸酯鍵，可以得到有藥用價值和保健功能的游離阿魏酸。而植物性原材料通過酯酶的處理細胞壁變得疏松，作為飼料工業的原料更容易被禽畜消化利用，作為制漿造紙工業的原料可以減少制漿工序化化學藥品的使用，減少污染，并有利于后續工序的進行。

1987年，阿魏酸酯酶在Streptomyces olivochromogenes中被第一次發現。研究表明真菌、細菌、酵母都能分泌酯酶，目前發現的產酶微生物有黑曲霉(Aaspergillusniger)，鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)，梭菌(Clostridium thermocellum)，乳酸桿菌(Lactobacilli sp.)，假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，但絕大多數酯酶是從真菌中分離出來。研究發現約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)有較強的阿酸酯酶活性，并且已經從中克隆表達出2個阿魏酸酯酶的基因(Biochemical Properties of TwoCinnamoyl Esterases Purified from a Lactobacillus johnsonii Strain Isolatedfrom Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats，Applied and environmentalmicrobiology，2009，5(15)，5018–5024)。通過對約氏乳桿菌的特性研究，該菌可能還有其它的酯酶。本專利公開了一種新型的約氏乳桿菌酯酶。

發明內容

本發明從約氏乳桿菌中克隆得到了一個新型的酯酶基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性。并用它進行了阿魏酸提取的應用。

本發明的技術方案如下：

1、菌株

本發明酯酶基因的來源菌株為：Lactobacillus johnsonii ATCC11506(從美國ATCC菌種庫購買)。

2、酯酶基因的克隆

提取Lactobacillus johnsonii ATCC11506菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出酯酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。

3、酯酶表達與純化

將重組質粒導入BL21大腸桿菌中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，再純化后冷凍干燥備用。

4、酯酶酶學性質

以阿魏酸甲酯為底物研究pH對本發明所述酯酶酶活的影響。

以阿魏酸甲酯為底物研究溫度對本發明所述酯酶酶活的影響。

以阿魏酸甲酯為底物測定了Fe²⁺、Ag⁺、Fe³⁺、K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺離子對酶活的影響。