[發明專利]一種酶聯免疫檢測禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒

有效

• 申請號: 201610082031.5
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105606826B
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 何誠;吳宗學;張強
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及檢測試劑盒，具體地說，涉及酶聯免疫檢測禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒。

背景技術

禽衣原體病(Avian Chlamydiosis)是由鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci，Cp)引起的一類家禽、鳥類及哺乳動物等人畜共患傳染性疾病。常常表現為禽類呼吸道和消化道疾病癥狀，感染家禽嗜睡、發燒、體重下降、鼻腔和眼睛異樣分泌物、氣囊炎、腹膜炎、心包炎、肝周炎以及產蛋禽產蛋量下降，病死率可達30％；觀賞鳥類感染后表現為食欲減退、體重減輕、腹瀉、黃色糞便、竇炎、呼吸道炎癥以及肝脾腫大、氣囊炎、心包炎、腹膜炎等癥狀。該病偶爾也會感染牛、羊和其它哺乳動物，引起動物生殖道炎性病變、孕畜流產等癥狀。人類在自然條件下可感染該病，主要引起呼吸道感染、肺炎和菌血癥，所以臨床上又稱之為鸚鵡熱(psittacosis)或鳥疫(Ornithosis)。

公開號為CN103981252A的中國專利申請公開了一種特異快速檢測鸚鵡熱嗜衣原體的TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR的方法。根據GenBank中牛鸚鵡熱衣原體主要外膜A蛋白的基因序列，利用Primer 5.0軟件設計引物，包括上游引物和下游引物序列，同時針對引物之間的基因片段設計TaqMAN探針，5’端標記FAM，3’端標記NFQ-MGB，擴增目標片段的長度為180bp。但該方法由于采集樣本過程繁瑣復雜不適于大量樣本的檢測，且所需設備價格昂貴，不能作為基層養禽業的衣原體常規檢測手段。此外，該方法中擴增目標片段只有180bp，很容易造成假陽性結果從而降低試驗準確率。

目前國內外對鸚鵡熱衣原體的主要檢測手段包括兩大類即抗原檢測和血清學檢測?？乖瓩z測方法有直接染色，免疫組織化學染色，病原分離和鑒定，免疫熒光技術，聚合酶鏈反應，雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗。血清學檢測方法有補體結合試驗，間接血凝試驗，膠體金試紙條法等。

直接染色病原法方法操作簡單、檢測快，但是靈敏性和特異性一般，結果判定需要有豐富的專業技術經驗，判定結果受主觀影響較大，尤其辨認衣原體的EB和RB時候相當困難。

病原分離鑒定方法病原分離需要禽胚或細胞，分離過程比較復雜并對試驗操作要求較高一般基層試驗室難以進行。免疫熒光抗體技術特異性強、敏感性高，是衣原體抗原鑒定比較理想的方法，但熒光顯微鏡價格昂貴不適合作為常規檢測方法。聚合酶鏈反應雖然有較高的特異性和敏感性制備模板比較復雜所需樣本量大，且需要PCR儀等貴重儀器，檢測試劑昂貴。

雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗方法具有簡便，靈敏，高效等特點但目前國內沒有能夠檢測禽衣原抗原的ELISA試劑盒。補體結合試驗操作繁瑣、敏感性低、檢測時間長、需要較高的專業知識，因此在臨床應用中受到較多限制。

間接血凝試驗方法操作程序簡單、不需要特殊設備，但是結果判定受主觀因素影響較大，而且耦合抗原多為全菌體，可能與部分革蘭氏陰性菌存在交叉反應，結果易產生假陽性。膠體金試紙條法操作簡單易行但檢測敏感性較低。

酶聯免疫吸附試驗是用于血清抗體檢測的常用方法，若能選擇并制備適宜的包被抗原及通用性好的酶聯二抗用于禽衣原體病ELISA抗體檢測，則可達到通用性好、操作簡便、所需時間短、降低操作人員主觀因素影響的目標，從而彌補上述對鸚鵡熱衣原體檢測方法的不足。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種酶聯免疫檢測禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供一種酶聯免疫檢測禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒，所述試劑盒包括：包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的固相載體，酶標抗體，禽鸚鵡熱衣原體陰性對照血清，禽鸚鵡熱衣原體陽性對照血清；所述鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，所述固相載體包被鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP后，經抗原保護劑處理，所述抗原保護劑含有2％的β-1，3/1,6葡聚糖，20％的甘油和0.01％的明膠，余量為PBS。

作為優選，本發明為了提供一種酶聯免疫反應試劑盒，所述固相載體為采用酶標板，如96孔酶標板。

進一步地，本發明提供了包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的酶標板的制備方法為：

1)以鸚鵡熱衣原體6BC株總DNA為模板，使用特異性引物MOMP-F和MOMP-R進行擴增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；