[發明專利]一種檢測胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的方法

有效

• 申請號: 201610081013.5
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105524978B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 徐煜;劉振民;游春蘋
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種同時、批量檢測微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將微生物培養液離心、取上清液；

(2)將一部分步驟(1)所述上清液90-100℃加熱1-3分鐘，得經過熱處理的上清液，剩余的步驟(1)所述上清液為未經過熱處理的上清液；

(3)將步驟(2)中所述經過與未經過熱處理的上清液與反應緩沖液按體積比1∶0.5-1∶2分別混合，所述反應緩沖液的組分為2-4.5g/L偶氮酪蛋白、25-45mM嗎啉丙磺酸和1.5-3mM氯化鈣，35-45℃反應2-3小時，加入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸終止反應，離心，取上清轉移至多孔板，向所述上清中加入強堿溶液至強堿終濃度為0.2-0.5M，分別檢測450nm吸光值；

(4)將步驟(3)所得450nm吸光值分別換算為步驟(2)所述經過熱處理與未經過熱處理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性，所述換算的方法為將樣品在450nm處的吸光值減去空白對照在450nm的吸光值得吸光值增值，再將所述吸光值增值換算為每毫升樣品每小時的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；所述胞外蛋白酶的耐熱性為所得經過熱處理與未經過熱處理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。

2.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(1)中，所述微生物培養液通過包括以下步驟的方法獲得：

1)將微生物接種于復壯培養基中30℃培養24h，得復壯培養液；

2)將步驟1)所述復壯培養液轉接至滅菌脫脂乳，30℃繼續培養48h，即得。

3.如權利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)中，所述復壯培養基為MPC培養基，所述MPC培養基的組分為5.0g/L胰化蛋白胨、2.5g/L酵母提取物和1.0g/L葡萄糖；和/或，步驟1)中所述培養為振蕩培養；和/或，步驟2)中，所述滅菌脫脂乳為滅菌脫脂復原乳；和/或，所述轉接的比例為體積比1∶10；和/或，步驟2)中所述培養為振蕩培養。

4.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中，所述加熱的溫度為95-100℃；和/或，所述加熱的時間較佳地為2-3分鐘；和/或，所述加熱為水浴或金屬浴加熱；和/或，所述一部分為1/2。

5.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中，所述經過與未經過熱處理的上清液與反應緩沖液按體積比1∶1混合。

6.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中，所述偶氮酪蛋白的濃度為3-4.5克/升；和/或，所述嗎啉丙磺酸的濃度為35-45mM；和/或，所述氯化鈣的濃度為1.5-2mM。

7.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中，所述反應的溫度為40℃；和/或，所述反應為2小時。

8.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中，所述三氯乙酸或三氟乙酸的濃度為2M；和/或，所述三氯乙酸溶液或三氟乙酸溶液的體積占反應體系總體積的1/10；和/或，所述強堿的終濃度為0.2M。

9.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)中，所述強堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀；和/或，所述強堿溶液的濃度為1M；和/或，所述離心的轉速為10000轉/分鐘；和/或，所述離心的時間為15分鐘；和/或，所述離心的溫度為25℃；和/或，所述多孔板為96孔板；和/或，檢測所述450nm處的吸收值將樣品批量置于所述多孔板中用酶標儀進行檢測。

10.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(4)中，所述空白對照為去離子水。