[發(fā)明專利]一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610080846.X
• 申請(qǐng)日: 2016-02-05
• 公開（公告）號(hào): CN105717084A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張奇亞;劉佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒學(xué)及水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法，同時(shí)還涉及一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法的用途。

背景技術(shù)

作為無(wú)囊膜病毒的代表，呼腸孤病毒是呈二十面體、具有雙層衣殼、含多節(jié)段雙鏈RNA基因組的病原病毒。呼腸孤病毒的宿主范圍極廣，能感染人、脊椎動(dòng)物(包括魚類)、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物，能引起宿主嚴(yán)重的病毒病，如導(dǎo)致魚類嚴(yán)重的出血病和高死亡率[張奇亞&桂建芳，2014，中國(guó)科學(xué):生命科學(xué),2014,44:1236–1252]。病毒入侵是其復(fù)制周期中至關(guān)重要的第一步。無(wú)囊膜病毒入侵宿主細(xì)胞的方式和過程與有囊膜病毒存在顯著差異[Groveetal,J.CellBiol，2011,195(7):1071-1082；Whiteetal,CritRevBiochemMolBiol,2008；43(3):189–219]。為了高效防控病毒病，須對(duì)病原入侵過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。利用新型材料，建立精準(zhǔn)、穩(wěn)定的單病毒顆粒示蹤技術(shù)，對(duì)了解無(wú)囊膜病毒是如何突破宿主屏障、入侵細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程及病毒與宿主的相互作用，進(jìn)而認(rèn)識(shí)無(wú)囊膜病毒的致病機(jī)制，研發(fā)系列新的抗病毒藥物及相關(guān)生物制劑具有重大意義。

近些年，通過在病毒的囊膜上進(jìn)行量子點(diǎn)(Quantumdots,DQs)標(biāo)記，可對(duì)有囊膜病毒進(jìn)行示蹤[Zhangetal,Biomaterials,2013,34:7506-7518；Zhangetal,Theranostics,2014,4(3):307-315]。但是，由于無(wú)囊膜病毒缺少囊膜，尚無(wú)法按照現(xiàn)有方法直接對(duì)無(wú)囊膜病毒進(jìn)行標(biāo)記。若單獨(dú)采用熒光染料標(biāo)記，則受到耐光性較弱、生物相容范圍有局限；而經(jīng)基因操作用熒光蛋白標(biāo)記，則可能使病毒的活性降低甚至喪失。因此，需建立既能應(yīng)新型納米材料量子點(diǎn)高抗光漂白性、長(zhǎng)熒光壽命和寬生物相容性等優(yōu)點(diǎn)[Zhaoetal,Chem.Commun.2008,41:5116–5118]，同時(shí)又適合對(duì)無(wú)囊膜病毒進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記的新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法，該技術(shù)標(biāo)記病毒顆粒穩(wěn)定可靠，均一性好，適用于對(duì)無(wú)囊膜病毒進(jìn)行標(biāo)記。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法的應(yīng)用。將量子點(diǎn)標(biāo)記的無(wú)囊膜病毒接種到在玻璃底小皿上長(zhǎng)成單層的敏感細(xì)胞中，再用綠色熒光染料指示細(xì)胞特定組分(如用細(xì)胞質(zhì)膜染料CellMask^TM染細(xì)胞膜)，置熒光顯微鏡下持續(xù)觀察量子點(diǎn)標(biāo)記無(wú)囊膜病毒(紅色)與細(xì)胞特定組分的相對(duì)位置，可實(shí)時(shí)追蹤病毒的運(yùn)動(dòng)軌跡。

這是一種針對(duì)無(wú)囊膜病毒長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)示蹤的高效方法。經(jīng)用外衣殼蛋白免疫熒光標(biāo)記無(wú)囊膜病毒測(cè)試及ImageProPlus軟件計(jì)算，該方法標(biāo)記無(wú)囊膜病毒的效率大于75％。

為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法，包括如下步驟：

1)在無(wú)囊膜病毒懸液中，加入生物素孵育，進(jìn)行無(wú)囊膜病毒的生物素化。

2)超速離心除去不完整的無(wú)囊膜病毒顆粒及其他雜質(zhì)；先將生物素化的病毒懸液離心，收集沉淀，加入PBS緩沖液懸浮，經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度(20％、30％、40％、50％及60％)離心，分別收集各離心條帶，加PBS洗滌后離心，收集沉淀，重懸于TE緩沖液中，負(fù)染電鏡觀察，獲得結(jié)構(gòu)均一、生物素化的無(wú)囊膜病毒。

3)將步驟2)獲得的生物素化無(wú)囊膜病毒接種于易感細(xì)胞，加量子點(diǎn)孵育，進(jìn)行無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記。

以上所述的方法中，優(yōu)選的，所述的無(wú)囊膜病毒為大菱鲆呼腸孤病毒(SMReV)。

以上所述的方法中，優(yōu)選的，離心速度為110,000g，離心溫度為4℃。

一種無(wú)囊膜病毒量子點(diǎn)標(biāo)記方法的應(yīng)用，包括該方法在監(jiān)測(cè)無(wú)囊膜病毒侵染細(xì)胞過程中的應(yīng)用，或是該方法在研究無(wú)囊膜病毒與宿主細(xì)胞互作中的應(yīng)用；或是在篩選抗無(wú)囊膜病毒制劑中的應(yīng)用。

具體的，利用所述的方法在監(jiān)測(cè)無(wú)囊膜病毒侵染細(xì)胞過程中的應(yīng)用的過程包括：量子點(diǎn)標(biāo)記無(wú)囊膜病毒接種的細(xì)胞，用細(xì)胞質(zhì)膜染料染色，熒光顯微鏡下對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記無(wú)囊膜病毒的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行示蹤；

利用所述的方法在研究無(wú)囊膜病毒與宿主細(xì)胞互作中的應(yīng)用包括：?jiǎn)螌蛹?xì)胞先利用融合熒光蛋白或熒光探針等對(duì)不同細(xì)胞組分進(jìn)行熒光定位，再接種的生物素化無(wú)囊膜病毒，進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記。將細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后固定，對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記無(wú)囊膜病毒與共定位細(xì)胞組分進(jìn)行熒光顯微觀察，以查明無(wú)囊膜病毒運(yùn)動(dòng)方向、軌跡及與細(xì)胞互作的組分。