[發明專利]一種提取微生物濕菌體胞內維生素K2粗品的方法

在審

• 申請號: 201610080583.2
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105541585A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 鄭之明;尉鴻飛;王鵬;劉會;王麗;吳荷芳;王晗;李哲敏;方雪;孫孝娟;孫小雯;吳錫華
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C07C46/10
• 分類號: C07C46/10;C07C50/14
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 丁瑞瑞

技術領域

本發明涉及生物工程領域，特別涉及直接提取微生物濕菌體胞內維生素K₂的方法，通過膜濃縮或離心對微生物發酵液進行菌液分離，然后選用合適的脫 水性有機溶劑對濕菌體進行預處理，再以合適的有機萃取劑對發酵產物進行萃 取，以達到最大的萃取得率，從而獲得維生素K₂粗品。

背景技術

天然維生素K₂(Menaquinone，MK，甲萘醌類，VK₂)是一類在動物體內 具有生物活性的脂溶性維生素，化學結構式為2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，MK可 分為14種，以MK-n表示，其中n指C-3側鏈上異戊二烯單元的個數。研究表 明，維生素K₂不僅可以促進血液凝固，增加骨鈣素合成，而且還可降低患肝癌 和前列腺癌的風險。最近的研究表明，維生素K₂還可用于帕金森氏綜合癥及肌 肉萎縮性側索硬化癥的輔助治療。歐盟已將維生素K₂作為一種功能性食品，在 美國，有關VK₂的藥用研究也已進入了臨床三期階段。

黃桿菌是一種能夠產生具有高生物活性、高生物相容性VK₂的革蘭氏陰性 菌。通過研究簡單、快捷、高效的萃取方法，對于VK₂的工業化生產和臨床應 用，具有重要的經濟和社會意義。

根據目前文獻報道，分離提取微生物胞內脂溶性發酵產物的方法主要有以 下幾種：

1、固-液萃取法

固-液萃取是指溶劑進入固態物料，將有效成分從固相轉移到液相的過程。 RobertoE.Armenta等(JAgricFoodChem，2006,54,9752-9758)利用固-液萃取 及超聲波輔助法，首先將發酵后的thraustochytridstrainONC-T18菌離心后凍干， 然后通過調節石油醚、丙酮、水的比例(15:75:10)從中提取了類胡蘿卜素。但 該方法耗時繁瑣，有機溶劑不易回收利用，因而不適于工業化生產。

2、皂化提取法

皂化提取是利用酯(尤指羧酸酯)在堿的作用下水解生成羧酸鹽和醇，再 獲取所要提取的有機物的方法。李聚海等(農產品加工學刊，2007,3:14-17)首 先將發酵后的菌體離心，然后將濕菌體凍干作為實驗材料，之后比較了研磨法、 酸熱法、超聲波法及反復凍融法對干菌體的破壁效果，選擇酸熱法作為最佳破 壁方法，最后用皂化法提取根癌土壤桿菌菌體中輔酶Q₁₀，獲得了較高的提取得 率。但該法步驟繁多，皂化反應需要較高的溫度，皂化過程中存在產物不同程 度的降解，需要加入抗氧化劑，并且皂化后有一定的副產物，增加了后續產物 分離純化的難度。

3、超臨界流體萃取

超臨界流體萃取分離技術是利用超臨界流體的溶解能力與其密度密切相 關，通過改變壓力或溫度使超臨界流體的密度大幅改變。在超臨界狀態下，將 超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地依次把極性大小、沸點高低 和相對分子質量大小不同的成分萃取出來。MaheshV等(BioprocessBiosystEng， 2012,35:809-816)在將菌體經離心凍干后，用超臨界CO₂萃取假單胞菌 (Pseudomonasdiminuta)干菌體中的輔酶Q₁₀,通過Box-behnken實驗優化萃取 參數，使萃取得率提高到了96.2％。劉國杰(現代食品科技，2013,29 (6):1346-1349)也是先將菌體離心后再用超臨界CO₂萃取深層發酵靈芝真菌 菌絲體中的麥角固醇，在進行了萃取條件優化后，使麥角固醇的萃取量達到了 1.1362mg/g。但是該法所用設備復雜，需要控制的萃取參數繁多，對資金及人員 都有較高的要求。

常見的菌液分離技術如絮凝、離心、過濾(例如谷氨酸發酵中的除菌，發 酵科技通訊，1993,22(4)：19-20；蘇氨酸發酵中的菌液分離，發酵科技通訊， 2014,43(4)：43-46)等只是作為一個單獨的工藝，并未與之后的工序融合到一 起，尤其是對于將菌液分離工藝與胞內產物萃取工藝相融合的技術工藝更是鮮 見。目前，對于提取微生物濕菌體中維生素K₂，尤其是適合工業化生產的提取 方法，尚未見報道。

發明內容