[發明專利]轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法

有效

• 申請號: 201610078469.6
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105648032B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 何松林;王政;賀丹;申萍;李永華;李曉娟
• 申請（專利權）人: 河南農業大學;河南科技學院
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張真真

本發明公開一種轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法，將轉基因牡丹愈傷組織從培養基中取出，用蒸餾水洗去殘留菌體，放入離心管中，加入Buffer A至沒過愈傷組織，置于24℃環境中，侵泡1 h，用移液槍將Buffer A吸出，加入Buffer B至沒過愈傷組織，置于24℃黑暗環境中染色過夜或數小時，至愈傷組織出現藍色。本發明將原GUS基因組織化學染色方法中的37℃優化為24℃。將試驗篩選得到的增殖生長良好的愈傷組織進行GUS組織化學染色的檢測，試驗結果成功檢測到GUS活性的表達，愈傷組織碎塊呈藍色，表明新生的愈傷組織中存在GUS活性位點。

技術領域

本發明屬于分子生物技術應用領域，涉及轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色溫度方法。

背景技術

GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因是轉基因植物使用較多的一種報告基因，具有檢測快速簡潔高效的特點。GUS組織化學法染色原理為：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細胞發生了gus基因的轉化，并表達出Gus，在適宜的條件(一般為37℃)下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍色產物，這是由其初始產物經氧化二聚作用形成的靛藍染料，它使具Gus活性的部位或位點呈現藍色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據染色深淺可反映出Gus活性。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個細胞內的表達情況。

在對轉基因牡丹愈傷組織進行GUS組織化學染色檢測時，參照Jefferson的方法，試驗中發現牡丹愈傷組織在37℃環境下染色后，全部褐化死亡，無GUS瞬時表達活性。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：針對牡丹愈傷組織在進行GUS組織化學染色時，37℃環境下，全部褐化死亡，無GUS瞬時表達活性。因此根據牡丹愈傷對溫度較為敏感的特性，需要對染色溫度進行調整。

本發明的技術方案是：一種轉基因牡丹愈傷組織的GUS基因組織化學染色方法：

將轉基因牡丹愈傷組織從培養基中取出，用蒸餾水洗去殘留菌體，放入離心管中，加入Buffer A至沒過愈傷組織，置于24℃環境中，侵泡1h，用移液槍將Buffer A吸出，加入Buffer B至沒過愈傷組織，置于24℃黑暗環境中染色過夜或數小時，至愈傷組織出現藍色；

Buffer A成分如下：

其中0.2M NaPO₄buffer溶液由0.2M Na₂HPO₄和0.2M NaH₂PO₄混合配制而成，每100ml的0.2M NaPO₄buffer溶液由62ml 0.2M Na₂HPO₄和38ml 0.2M NaH₂PO₄混合而成，Buffer A置于4℃保存；

Buffer B由Buffer A和X-gluc混合配制而成，X-gluc的濃度為1mg/ml，Buffer B置于-20℃，避光保存。

0.2M Na₂HPO₄配制方法：將7.16g Na₂HPO₄溶于水，定容至100ml；0.2M NaH₂PO₄的配制方法：將3.12g NaH₂PO₄溶于水，定容至100ml。