[發(fā)明專利]馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP及其應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610078345.8
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105693838A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 梁海鷹;吳羽媛;雷倩楠;朱家萍;王志新
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/11;C12Q1/68;A61P31/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 張月光;林偉斌

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體涉及馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP及其應用。

背景技術

抗菌肽是一種天然的多肽，它不會像抗生素那樣產生耐藥性，而且在很多海洋生 物中都存在。當一些傳統(tǒng)的抗生素被禁止使用之后，很多學者轉向了抗菌肽的研究，并取得 了一系列的成果。抗菌肽能夠提高植物抗病能力，人們將一些抗菌肽的基因導入到植物中， 讓植物具有抵抗某些病害的作用，在食品中，一些添加劑會給人們的身體造成危害，將抗菌 肽應用到食品防腐保鮮劑能夠有效的殺死一些霉腐微生物而且對人體不帶來傷害。凌斌勛 等發(fā)現(xiàn)柞蠶抗菌肽具有抗瘤效果。對于水產養(yǎng)殖中的應用也十分重要，水環(huán)境中是微生物 生長比較密集的地方，因此抗菌肽是魚、蝦、貝最有效的防御病害的免疫因子。目前對海洋 生物抗菌肽的研究多集中在雙殼貝類和甲殼類等低等生物。其中雙殼貝類抗菌肽分子的研 究又多集中在貽貝屬都取得了相應的成果。

馬氏珠母貝屬于雙殼貝類，缺乏特異性免疫系統(tǒng)，防御系統(tǒng)完全靠細胞免疫和體 液免疫因子。近年來因沿海水質的日趨惡化，各種病害也頻繁發(fā)生，致使馬氏珠母貝因病害 發(fā)生大量死亡，對我國珍珠產業(yè)帶來嚴重的經濟損失，提高馬氏珠母貝抗脅迫能力是目前 亟需解決的問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP基因。

本發(fā)明的另一個目的是提供馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP的應用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：

一種馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

本發(fā)明利用高效液相色譜從馬氏珠母貝血清中分離得到一種未知的具有抑菌活 性的蛋白成分。通過質譜測序得到部分氨基酸序列，將該序列在馬氏珠母貝蛋白庫中搜索， 得到一條與其相匹配的蛋白序列，找到與它相對應的基因序列，以之為模板克隆得到cDNA 全長。在NCBI上比對，沒有找到與它相匹配的蛋白，以在線SMART程序，發(fā)現(xiàn)它沒有結構域， 初步認為它是一種新的蛋白。命名為PmAMP（PinctadamartensiiAntimicrobial peptide）。

通過RACE的方法，獲得編碼抗菌肽PmAMP的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2或 SEQIDNO：3所示；氏珠母貝抗菌肽（PmAMP）基因cDNA全長為700bp，包括了156bp的5'UTR和 250bp的3'UTR，其中開放閱讀框為294bp，編碼了97個AA。

研究發(fā)現(xiàn)所獲得馬氏珠母貝PmAMP能明顯抑制大腸桿菌和藤黃微球菌的生長，因 此，本發(fā)明還提供1所述馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP在抑制大腸桿菌和藤黃微球菌生長中的用 途。

另外，本發(fā)明還設計了一對檢測所獲得馬氏珠母貝PmAMP基因的熒光定量引物，用 于分析馬氏珠母貝PmAMP基因在各組織中的表達情況，因此本發(fā)明還保護一對檢測所述馬 氏珠母貝抗菌肽PmAMP基因的熒光定量引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：4~5所示。

本發(fā)明還提供包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所述馬氏珠母貝抗菌肽PmAMP基因 的重組載體；同樣還提供含有權利要求5所述重組載體的重組菌。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明以馬氏珠母貝為研究對象，運用高效液相色譜儀對其血清進行分離純化，篩選 出具有抑菌活性的蛋白，所獲得馬氏珠母貝PmAMP能明顯抑制大腸桿菌和藤黃微球菌的生 長，通過質譜測序，采用RACE技術克隆cDNA全長，獲得編碼抗菌肽PmAMP的基因，其核苷酸序 列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示；氏珠母貝抗菌肽（PmAMP）基因cDNA全長為700bp，包 括了156bp的5'UTR和250bp的3'UTR，其中開放閱讀框為294bp，編碼了97個AA。

應用熒光定量PCR檢測PmAMP在組織中的表達含量，發(fā)現(xiàn)閉殼肌中表達含量最高， 而在血液中表達含量較低，用細菌刺激之后，發(fā)現(xiàn)8h在血細胞中含量最高，有顯著差異性， 表明了PmAMP是一種免疫蛋白，本研究為馬氏珠母貝的免疫研究和馬氏珠母貝病害防治提 供了新的資料。

附圖說明

圖1為馬氏珠母貝血清分離組分對藤黃微球菌和大腸桿菌生長抑制圖。