[發明專利]干細胞培養基及培養宮內膜干細胞的方法

在審

• 申請號: 201610078092.4
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105586308A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 戴玲華;戴唯悠
• 申請（專利權）人: 杭州易文賽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;A01N1/02
• 代理公司: 杭州華知專利事務所 33235
• 代理人: 楊淑芳

1.干細胞培養基，其特征在于包含以下組分：低糖DMED培養基，胎牛血清， 青鏈霉素雙抗溶液，硫酸慶大霉素，谷氨酰胺。

2.根據權利要求1所述的干細胞培養基，其特征在于各組分按體積含量各占總 體積百分比，低糖DMEM培養基占82％，胎牛血清占15％，青鏈霉素雙抗溶液 占1％，硫酸慶大霉素占1％，谷氨酰胺占1％。

3.一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于包括將采集到的經血與子宮內膜 組織分開收集，然后分別用如權利要求1或2所述的干細胞培養基進行培養分別 得到經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞，再將經血貼壁細胞和子宮內膜貼壁細胞 于細胞培養瓶培養，用胰酶消化收集貼壁細胞，接種于細胞共培養皿，再用如權 利要求1或2所述的干細胞培養基進行培養。

4.根據權利要求3所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于包括如下操 作步驟：

步驟1：采集經血與子宮內膜組織，將經血轉移至含肝素鈉的無菌離心管中，子 宮內膜組織轉移至無菌培養皿，離心管與培養皿用封口膜封住，24h內低溫 (4～8℃)運輸至實驗室；

步驟2：將步驟1所得離心管中的經血與生理鹽水充分混合，然后與Ficoll分離 液1:1疊加，離心，收集單個核細胞；生理鹽水重懸單個核細胞，離心洗滌，去 除紅細胞、血小板、細胞碎片；離心的細胞沉淀用如權利要求1或2所述的干細 胞培養基重懸并接種于T25細胞培養瓶，放置于37℃、5％CO₂培養箱培養7天， 中間每2～3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；

步驟3：將步驟1所得培養皿中的子宮內膜組織加入到消化液中，靜置消化半小 時，再加入等體積緩沖液稀釋消化液，再用1ml槍頭吹打組織，將組織與稀釋過 的消化液混勻，過篩網，使細胞分散、分離，去除未消化組織；經過篩網濾過的 細胞用生理鹽水重懸，離心，去除上清，再加入空白低糖DMEM培養基重懸細 胞，離心，收集細胞沉淀；再向細胞沉淀中加入如權利要求1或2所述的干細胞 培養基重懸細胞；接種于T25細胞培養瓶，放置于37℃、5％CO₂培養箱培養7 天，中間每2～3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；

步驟4：將步驟2及步驟3所得貼壁細胞接種于T25細胞培養瓶繼續培養7天后， 用胰酶消化收集貼壁細胞，貼壁細胞經過離心洗滌，接種于細胞共培養皿，上層 為步驟2所述經血貼壁細胞，下層為步驟3所述子宮內膜貼壁細胞，所述細胞接 種密度為1×10⁶細胞/ml，采用如權利要求1或2所述的干細胞培養基，共培養7 天，細胞獲得大量擴增；

步驟5：宮內膜干細胞凍存：當細胞擴增到1～3×10⁷細胞時，按照(3～5)×10⁶細胞/ml加入1ml細胞凍存液；將含有細胞的凍存液轉移至1.5ml凍存管，凍存 管放入凍存盒，凍存盒置于-80℃，24h后，再將凍存盒中的凍存管轉入-196℃ 液氮儲存；

步驟6：宮內膜干細胞復蘇：將儲存于-196℃液氮中的宮內膜干細胞凍存管取出， 迅速放置于40℃水浴鍋中，溶解1-2min，取1ml解凍細胞懸液轉移至15ml離 心管，加入10ml體積的空白DMEM培養基充分混勻，離心，重復洗滌一遍， 再將本發明提供的干細胞培養基加入細胞沉淀，以1×10⁶細胞/ml接種于T75細 胞培養瓶，放置于37℃、5％CO₂培養基培養，可連續傳代20次以上。

5.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟2 中的生理鹽水含有1％青鏈霉素雙抗溶液；所述離心洗滌步驟包括2次離心，分 別用生理鹽水重懸細胞沉淀，然后離心。

6.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟3 中緩沖液為含0.5％Ⅲ膠原蛋白酶的磷酸緩沖液。

7.根據權利要求4所述的一種培養宮內膜干細胞的方法，其特征在于所述步驟2 中以細胞濃度3×10⁵/ml接種于T25細胞培養瓶。