[發明專利]長期保存牡蠣樣品中脂溶性貝類毒素的檢測方法

在審

• 申請號: 201610077534.3
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN107024547A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 徐靜;張琳;邵筠喬;曹際娟
• 申請（專利權）人: 徐靜;張琳;邵筠喬;曹際娟
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/86
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司21238
• 代理人: 劉曉琴

技術領域

本發明屬于生物分析領域，涉及長期保存的復雜生物樣品牡蠣中脂溶性貝類毒素的檢測方法，尤其涉及檢測結果中假陽性部分的校正方法。

背景技術

牡蠣味道鮮美，營養豐富，含有豐富的不飽和脂肪酸，如亞油酸、亞麻酸、二十二碳六烯酸等。但有實驗研究發現不飽和游離脂肪酸并不是絕對安全的。早在1982日本學者Takagi T等使用游離脂肪酸標準品對小鼠進行腹腔注射，發現C20∶4n-6,C18∶3n-3,C20∶5n-3表現出高毒性,而C18∶2n-6,C22∶6n-3表現出低毒性，C18∶1n-9幾乎無毒(Toxic effect of free polyenoic acids:a fat soluble marine toxin.Bull Fac Fish Hokkaido Univ 1982,33(4):255-262.)。之后Takagi T等進一步對不飽和游離脂肪酸的毒害作用進行研究，發現其中的多烯游離脂肪酸可能是小鼠生物法檢測腹瀉性貝毒假陽性結果的主要來源(Toxic effect of free unsaturated fatty acids in the mouse assay of diarrhetic shellfish toxin by intnperitoneal injection.Bull Jpn Soc Sci Fish 1984,50:1413-1418.)。

針對此問題，很多學者進行探索研究。唐倩囡等發現儲藏溫度和時間等因素會引起貝類腸腺產生某種生化物質，最終導致小白鼠死亡出現假陽性結果，從而影響小鼠法檢測貝毒的結果(貝類低溫儲存后對腹瀉性貝毒檢疫的影響[J].湖北農業科學,2009,07:1722-1723.)。沈志剛采用1％硫酸-甲醇甲酯化脂肪酸方法和聚乙二醇(PEG)涂層的毛細管色譜柱對陰性牡蠣樣品中游離脂肪酸進行研究，并對其隨儲存時間和儲存溫度含量變化進行監測分析，發現當-10℃冷凍保存四個月C20∶5n-3含量為389.0mg/kg，相當于1ml中小鼠腹腔注射液含有7.78mg C20∶5n-3，可造成小鼠死亡(牡蠣產品腹瀉性貝毒檢測假陽性結果的產生原因及其控制措施[D].中國農業科學院,2009.)。由此可見，經過一定時期保存的牡蠣樣品中可能產生呈檢測陽性的毒素類物質，而這些物質是在保存過程中產生，即時的檢測值不能反應留存樣品原始真實的貝類毒素含量，導致回溯性研究無法獲得準確的數據信息。

當前脂肪酸的檢測，前處理的衍生化法主要有堿法甲酯化、硫酸甲醇甲酯化、三氟化硼甲酯化。堿法甲酯化只適合于脂肪；硫酸-甲醇甲酯化既適于游離脂肪酸，又適合于結合態脂肪酸(脂肪)，但是容易造成長鏈脂肪酸(碳鏈長度大于20個碳原子)的損失。三氟化硼法能利用快速皂化使脂肪酸鹽直接轉化成脂肪酸甲酯，減少酸化提取手續，并可防止常規法皂化時所引起的異構化。

本發明即擬深入研究采用三氟化硼甲酯化方法對留存牡蠣樣品中脂溶性貝類毒素進行校正性檢測的方法，以提供一種可以通過檢測留存貝類樣品中貝類毒素含量來獲得原產樣品中毒素準確含量的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠校正檢測陽性錯誤的應用于長期保存牡蠣樣品中脂溶性貝類毒素的檢測方法，所述方法包括如下步驟：

(1)待測樣品預處理；

(2)提取樣品游離脂肪酸；

(3)游離脂肪酸三氟化硼甲酯化后氣相色譜檢測；

(4)結果校正。

所述檢測方法中，步驟(4)結果校正根據公式i～iv進行：

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+103.27/6000)*X_m i

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+111.10/6000)*X_n ii

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+111.99/6000)*X_p iii

(a/4+83.8/6000)*20＝(a/4+144.47/6000)*X_q iv

其中a是原始采集牡蠣樣品中脂溶性貝類毒素的含量，X_m、X_n、X_p和X_q分別為保存第m、n、p、q天的樣品取樣量，其中m、n、p、q各自獨立地地選自0～8的整數。其中所述的m、n、p、q優選分別是1、3、5、7。