[發明專利]一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝

在審

• 申請號: 201610077518.4
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105541997A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 楊篤才;梁小明;何淑琴;楊智;劉宇良;匡青芬
• 申請（專利權）人: 江西博雅生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/745
• 分類號: C07K14/745;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 薛端石

1.一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在于，收集冷沉淀提取凝血 因子Ⅷ的廢料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制備中經層析柱流出來的液體作為原料；在血管 性血友病因子的制備工藝中，對經層析后的蛋白液在層析緩沖液中加入甘氨酸保護vWF活 性；優選層析后凍干前的蛋白液中加入賴氨酸、甘氨酸和白蛋白作為凍干保護劑，保護vWF 活性；優選層析緩沖液中甘氨酸質量濃度0.6％～1％，凍干保護劑中賴氨酸質量濃度2～3％， 甘氨酸質量濃度0.2％，白蛋白質量濃度0.8～1.3％。

2.根據權利要求1所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，用一步Q-Sepharose陰離子交換層析及一步親和層析純化得到純度較高的vWF：收集冷 沉淀提取凝血因子Ⅷ的廢料即在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的制備中經層析柱流出來的液體作為 原料；通過Q-Sepharose離子交換柱層析后，收集洗脫液，再經明膠親和層析，去除殘余的 纖維結合蛋白及雜質，得到血管性血友病因子。

3.根據權利要求1所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的的制備工藝包括：冷沉淀溶解、2％氫氧化鋁凝膠吸附、調節離 子強度、串聯過濾、S/D滅活、離子交換層析；離子交換層析收集洗脫液，洗脫液經超濾、 透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產。

4.根據權利要求1、2或3所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其 特征在于，

(1)通過調整洗滌緩沖液B和洗脫緩沖液B中的鹽濃度；采用Q-Sepharose柱層析法去 除纖維蛋白原和纖維結合蛋白及其它雜蛋白；

(2)經Q-Sepharose柱層析后的洗脫液，再經明膠層析，通過調整洗脫緩沖液B和透析 液的鹽濃度，去除殘余的纖維結合蛋白及雜質，即得含高純度vWF的流穿液。

5.根據權利要求3所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，S/D滅活前串聯過濾使用的濾芯尺寸為1.0μm和0.45μm的濾芯。

6.根據權利要求3所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，離子交換層析流穿液收集后，先濃縮一倍，再用洗滌緩沖液B等體積超濾6次，再經 Q-Sepharose層析柱，用洗脫緩沖液B收集洗脫下來的蛋白液。

7.根據權利要求4所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，所述的洗滌緩沖液B的配方：4g枸櫞酸鈉，11.4g氯化鈉，3g氯化鈣，6g甘氨酸，加適 量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節pH為5.8～6.8。

8.根據權利要求4所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，所述的洗脫緩沖液B配方：4g枸櫞酸鈉，16.38g氯化鈉，3g氯化鈣，6g甘氨酸，加 適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節pH為5.8～6.8。

9.根據權利要求4所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，所述的透析液配方：2.94g枸櫞酸鈉，25g氯化鈉，0.111g氯化鈣，30g甘氨酸，2g鹽 酸賴氨酸，人血白蛋白8g，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節pH為6.8～ 7.2。

10.根據權利要求1所述的一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，其特征在 于，制備工藝如下：

(1)收集冷沉淀；

(2)將步驟(1)的冷沉淀加入3IU/ml肝素鈉溶液中，攪拌至冷沉淀完全溶解，循環水 的溫度控制在28～37℃；開始離心，收集上清液，稱重；

(3)將步驟(2)的制得物上清液用1mol/LHCL調節pH至6.0～7.0；加入2％氫氧化 鋁凝膠，攪拌；開始離心，收集上清液，稱重；

(4)按“調節離子強度緩沖液W＝上清液重量/10”計算，稱取計算量的調節離子強度緩 沖液至步驟(3)的制得物上清液中；調節上清液pH至6.0～7.0；用調節蛋白濃度緩沖液調 節蛋白濃度不大于10g/L；用1.0μm的濾芯和0.45μm的濾芯串聯過濾，收集過濾液，稱重；

(5)按步驟(4)的制得物過濾液體積的1/10加入S/D溶液，攪拌均勻，溫度控制在24～ 26℃，連續保溫6小時；0.45μm濾芯過濾；過濾液用30KD超濾膜濃縮至蛋白濃度2％，然 后用蛋白液重量的2倍以上洗滌緩沖液A恒體積超濾，得超濾液，稱重；

(6)將步驟(5)的制得物超濾液用離子交換柱進行層析純化，用洗滌緩沖液A洗滌柱 子直至成基線，用洗脫緩沖液A洗脫，收集洗脫液；

(7)收集步驟(6)經層析柱流出來的液體，濃縮一倍，洗滌緩沖液B等體積超濾6次， 得超濾液，稱重；

(8)將步驟(7)的制得物超濾液用Q-Sepharose陰離子交換層析柱進行層析純化，用 洗滌緩沖液B洗滌柱子直至成基線，用洗脫緩沖液B洗脫，收集洗脫液，稱重；

(9)將步驟(8)的制得物洗脫液明膠親和層析進行純化，用洗脫緩沖液B洗滌柱子直 至成基線，收集上樣后經層析柱流出來的液體，用透析液透析、稀釋至效價100IU/ml，得蛋 白液，稱重；

(10)將步驟(9)的制得物蛋白液經0.2μm除菌濾芯過濾分裝；分裝好的制品傳入凍干 柜進行冷凍干燥；出柜扎蓋；99～100℃、30分鐘干熱病毒滅活；送檢，檢驗合格后包裝、 入庫；

所述百分數除有限定之外，其余為質量百分數；

優選：步驟(4)所述的調節離子強度緩沖液的配方：離子強度緩沖液的配制方法：48.5g 三羥甲基氨基甲烷，10g氯化鈣，100g氯化鈉，28.1g甘氨酸，加適量注射用水充分溶解， 補加注射用水至1L，調節pH為6.0～7.0；蛋白濃度緩沖液的配制方法：量取0.05L調節離 子強度緩沖液，加注射用水至1L，調節pH為6.0～7.0；

優選：步驟(5)所述的洗滌緩沖液A的配方：2.5g三羥甲基氨基甲烷，10g氯化鈣，25g 氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節pH為6.0～7.0；

優選：步驟(6)所述的洗脫緩沖液A配方：2.5g三羥甲基氨基甲烷，15g氯化鈣，40.9g 氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節pH為6.0～7.0。