[發明專利]病毒載體顆粒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201610077434.0
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105567739B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 孟疆輝;剛軼金;孟寶璽
• 申請（專利權）人: 鄭州可爾利爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/861;C12N15/864;C12N15/869;A61K45/06;A61P29/00;A61P19/02
• 代理公司: 河南科技通律師事務所 41123
• 代理人: 韓松;張曉輝

1.一種病毒載體顆粒，包括pspax2、pmd2.G和pwpi質粒，其特征在于：所述pwpi質粒包含啟動子、肉毒素D型酶活區以及內部核糖體進入位點序列；所述肉毒素D型酶活區的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述肉毒素D型酶活區序列的起始編碼序列之前插入有增強表達序列ACCATGGGC；所述病毒為慢病毒。

2.權利要求1所述病毒載體顆粒的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）將細胞系 lenti-x293T的細胞密度培養至70%；

（2）洗去培養液中的血清，換成無血清的DMEM培養基；

（3）將權利要求1中所述pspax2、pmd2.G和pwpi質粒用磷酸鈣轉染法轉染到lenti-x293T細胞中；

（4）四小時后，洗掉轉染液，加入含10wt%小牛血清的培養液進行培養；

（5）回收培養液，將細胞碎片過濾，再進行超速離心，即可獲得高滴度的病毒載體顆粒。

3.根據權利要求2所述的病毒載體顆粒的構建方法，其特征在于：步驟（3）所述pwpi、pmd2.G和pspax2的轉染用量比例為2：1：10。

4.根據權利要求2所述的病毒載體顆粒的構建方法，其特征在于：步驟（3）所述轉染法具體包括以下步驟：

①在10mL的Falcon管A中加入288μL 2mol/L的 CaCl₂溶液，以及pwpi質粒10μg、 pmd2.G質粒5μg和pspax2質粒100μg，補水到2880μL的總體積；

②在10mL的Falcon管B中加入2880μL的2xHBS buffer，再將Falcon管A中液體滴入Falcon管B，在2～3秒內迅速混合均勻；

③將所得混合液在室溫下放置15～20分鐘，再滴入長有lenti-x293T細胞的直徑為15cm的培養皿中。

5.根據權利要求2所述的病毒載體顆粒的構建方法，其特征在于：將所述細胞碎片通過0.45μm過濾器進行過濾；所述超速離心的轉速為30000rpm，時間為2h。