[發明專利]一種花生黃色斑點病毒檢測試劑盒及其檢測方法與應用

在審

• 申請號: 201610077250.4
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105548543A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 丁銘;尹躍艷;盧訓;李婷婷;張仲凱
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 謝喬良;何曉鈞

1.一種花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于包括盒體、硝酸纖維素膜、顯色液試 劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶；

所述的顯色液試劑瓶包括顯色試劑瓶A和顯色液試劑瓶B；

所述的抗體試劑瓶包括一抗試劑瓶和二抗試劑瓶；

所述的對照試劑瓶包括GYSV標準陽性對照試劑瓶和GYSV標準陰性對照試劑瓶。

2.根據權利要求1所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的硝酸纖維 素膜設有方格，方格中空白處用以點樣。

3.根據權利要求1所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的顯色液試 劑瓶A含有NBT顯色液；顯色液試劑瓶B含有BCIP顯色液。

4.根據權利要求3所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的NBT顯色液 是將0.5gNBT溶于10ml70%的二甲基甲酰胺；BCIP顯色液是將0.5gBCIP溶于10ml100%的 二甲基酰胺。

5.根據權利要求1所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的一抗試劑 瓶含有花生黃色斑點病毒特異性多克隆抗體；二抗試劑瓶含有特異性羊抗兔。

6.根據權利要求5所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的含有花生 黃色斑點病毒特異性克隆抗體的制備是采用其N基因原核表達的方法得到免疫源，免疫家 兔獲得，使用效價為1:500～20000；花生黃色斑點病毒N基因PCR擴增引物根據丁銘 （Ding.M.）注冊報道的GYSV甜椒分離物N基因全序列設計（注冊號為：EF528556），引物序列 及其退火溫度具體見下表：

。

7.根據權利要求1所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒，其特征在于所述的GYSV標準 陽性對照試劑瓶含有感染GYSV的本氏煙植物干粉；GYSV標準陰性對照試劑瓶含有健康本氏 煙植物干粉。

8.一種權利要求1~7任一所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于包括以下步驟：

1）根據檢測樣品數量剪下硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。

2）檢測樣品加入洗滌緩沖液研磨，移液器取2.5μl研磨液點至硝酸纖維膜方框中，同 時點上標準陽性對照和標準陰性對照，室溫放置或37℃放置至膜徹底干燥；

3）將膜移至容器，加入封閉緩沖液，室溫或37℃封閉1h；

4）在封閉緩沖液中加入一抗，室溫搖床搖勻，37℃培育1h或4℃培育過夜；

5）棄去一抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5min；

6）棄去洗滌緩沖液，加入封閉緩沖液，再在封閉緩沖液中加入二抗，室溫搖床搖勻，37 ℃培育1h或4℃培育過夜；

7）棄去二抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5min；

8）棄去洗滌緩沖液，顯色緩沖液洗膜1次，每次5min；

9）棄去顯色緩沖液，加入顯色液黑暗處顯色，充分顯色后將膜移至清水中終止顯色，分 析并記錄檢測結果。

9.一種權利要求1~7任一所述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒的應用，其特征在于所 述的花生黃色斑點病毒檢測試劑盒在檢測花生黃色斑點病毒中的應用。