[發明專利]基于21個線粒體SNP位點的法醫學快速檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201610076872.5
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105543388B
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 嚴江偉;楊雅冉;楊猛;陳婧
• 申請（專利權）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于21個線粒體SNP位點的法醫學快速檢測試劑盒，其特征在于：所述的法醫學快速檢測試劑盒包括⑴富集引物的混合物，⑵21條單堿基延伸引物混合物，⑶擴增試劑：dNTPs和快速Taq聚合酶，⑷核酸純化柱，⑸SNaPshot反應混合液，⑹Hi-Di甲酰胺，⑺GeneScan^TM Size Standards-120LIZ，⑻陽性對照：DNA 9947A，⑼陰性對照：ddH2O；

所述的富集引物的混合物包括用于擴增線粒體nt25～343、nt365～675、nt16132～16552、nt8158～8488、nt8504～8808和nt10285～10682六個區域的6對富集引物；所述的6對富集引物的序列及工作濃度為：

SEQ ID NO：1，0.31μM SEQ ID NO：2，0.32μM

SEQ ID NO：3，0.30μM SEQ ID NO：4，0.30μM

SEQ ID NO：5，0.36μM SEQ ID NO：6，0.34μM

SEQ ID NO：7，0.31μM SEQ ID NO：8，0.33μM

SEQ ID NO：9，0.32μM SEQ ID NO：10，0.30μM

SEQ ID NO：11，0.34μM SEQ ID NO：12，0.33μM;

所述的21條單堿基延伸引物的序列及工作濃度為：

SEQ ID NO：13，0.21μM SEQ ID NO：14，0.20μM

SEQ ID NO：15，0.22μM SEQ ID NO：16，0.20μM

SEQ ID NO：17，0.20μM SEQ ID NO：18，0.23μM

SEQ ID NO：19，0.25μM SEQ ID NO：20，0.23μM

SEQ ID NO：21，0.20μM SEQ ID NO：22，0.21μM

SEQ ID NO：23，0.22μM SEQ ID NO：24，0.25μM

SEQ ID NO：25，0.20μM SEQ ID NO：26，0.20μM

SEQ ID NO：27，0.21μM SEQ ID NO：28，0.23μM

SEQ ID NO：29，0.22μM SEQ ID NO：30，0.23μM

SEQ ID NO：31，0.23μM SEQ ID NO：32，0.21μM

SEQ ID NO：33，0.25μM。

2.如權利要求1項所述的法醫學快速檢測試劑盒在案件排查、個體識別以及尸源認定中的應用。

3.利用權利要求1所述的快速檢測試劑盒進行個體識別檢測的使用方法， 其特征在于：所述的使用方法包括以下步驟：

⑴.線粒體DNA提取：從待測生物檢材中提取線粒體DNA；

⑵.復合擴增反應：取步驟⑴所得的線粒體DNA作為復合擴增模版，加入富集引物的混合物和擴增試劑，進行單管內復合擴增反應，PCR擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性15s， 55℃退火5s，72℃延伸10s，共30個循環，最后72℃延伸2min，獲得復合擴增產物；

⑶.復合擴增產物純化：用核酸純化柱純化步驟⑵所得的復合擴增產物；

⑷.單堿基延伸反應：取步驟⑶所得的純化后的復合擴增產物，加入單堿基延伸引物混合物和SNaPshot反應混合液，進行單管內單堿基延伸反應，單堿基延伸反應程序為：96℃10s，50℃5s，60℃30s，共20個循環，獲得單堿基延伸產物；

⑸.電泳：取步驟⑷所得的單堿基延伸產物，加入Hi-Di甲酰胺、GeneScan^TM SizeStandards-120LIZ，混合均勻后，于95℃變性3min，4℃迅速冷卻后進行熒光電泳檢測和基因型分析。

4.如權利要求3所述的使用方法，其特征在于：所述的使用方法步驟⑷中SNaPshot反應混合液的加入量為1～1.5μL；所述的單堿基延伸反應的總體積為5μL。

5.如權利要求3或4所述的使用方法，其特征在于：所述的使用方法步驟⑷中的純化后的復合擴增產物的加入量為1～5ng。