[發(fā)明專利]一種高生長速率的隱甲藻突變株的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610076812.3
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105602982B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉璐;刁進(jìn)進(jìn);陳磊;張衛(wèi)文
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明藻能生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.一種高生長速率的隱甲藻突變株的構(gòu)建方法，其特征是包含如下步驟：

1） 隱甲藻光合作用相關(guān)基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：

采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的登記號為EB086308.1的隱甲藻Rubisco序列設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，以隱甲藻的cDNA為模板進(jìn)行PCR，純化目的片段，連入pTZ57R/T載體并測序；

2）用于同源雙交換整合的基因片段的構(gòu)建：

① 隱甲藻Rubisco基因上游片段的擴(kuò)增：

利用隱甲藻基因組為模板，以Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻Rubisco基因的上游片段；

② 隱甲藻Rubisco基因下游片段的擴(kuò)增：

利用隱甲藻基因組為模板，以Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻Rubisco基因的上游片段；

③ 潮霉素抗性基因片段的擴(kuò)增：

以pCAMBIA1301植物表達(dá)載體為模板，hpt上下游引物進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得潮霉素抗性基因片段；

④用于同源雙交換刪除Rubisco基因的DNA片段的構(gòu)建：

以隱甲藻Rubisco基因上游片段、隱甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，進(jìn)行融合PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得目的片段；

3）Rubisco基因的的刪除和突變株的構(gòu)建：

① 隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞的制備：

取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48 h的細(xì)胞10 mL，4 °C, 3500 rpm離心5 min，棄上清，加入1 mL25 mM DTT溶液，30 °C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL 1 M 山梨糖醇（sorbitol）清洗細(xì)胞三次，1 mL 山梨糖醇重懸細(xì)胞備用；

② 隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：

在無菌條件下取200 μL 隱甲藻感受態(tài)細(xì)胞置于2 mm電極杯中，加入1 μL 鮭魚精DNA和2 μg 目的片段混勻，冰浴5 min，電擊轉(zhuǎn)化條件為2.0 kV，電阻200 Ω，電容25 μF，電擊之后冰浴5 min，加入2 mL新鮮液體C9N2培養(yǎng)基，25 °C，180 rpm震蕩復(fù)蘇48 h，取50 μL細(xì)胞懸浮液均勻涂布在含有40 mg/L潮霉素B的固體C9N2培養(yǎng)基平板上，倒置培養(yǎng)2周，將平板上長出的單克隆細(xì)胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上劃線，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的復(fù)篩，待長出單克隆細(xì)胞，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)，并進(jìn)行突變體鑒定；

4) 刪除突變體的分子生物學(xué)鑒定：

分別提取野生型和突變株隱甲藻細(xì)胞的基因組，以hpt基因上下游引物進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

5) 刪除突變體的生長特性分析：

在C27N7.5的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床設(shè)置參數(shù)為轉(zhuǎn)速180 rpm，溫度25 °C；

步驟為：接種時取OD_{490 nm}為0.8的新鮮細(xì)胞5 mL加入20 mL培養(yǎng)基中，每組做三個平行樣，用UV-1750分光光度計(jì)測定波長為490 nm下的吸光值，每12 h測量一次，繪制柱狀圖；可以觀察到在液體培養(yǎng)基C27N7.5中，突變株的生長速率比野生株要快；

所述步驟2）中④所述獲得目的片段是指上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一個完整融合PCR產(chǎn)物；

所述步驟3）中②所述新鮮液體C9N2培養(yǎng)基是由葡萄糖9 g、酵母浸粉2 g、海鹽25 g，加水至1 L而成；

所述步驟3）中②所述含有40 mg/L潮霉素B的固體C9N2培養(yǎng)基是由葡萄糖9 g、酵母浸粉2 g、海鹽25 g、瓊脂粉15 g，加水至1 L而成；

所述步驟5）中所述C27N7.5液體培養(yǎng)基是由葡萄糖27 g、酵母浸粉7.5 g、海鹽25 g，加水至1 L而成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述隱甲藻為寇氏隱甲藻。