[發(fā)明專利]馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610076405.2
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105585626A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁海鷹;雷倩楠;吳羽媛;朱家萍;王志新
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東海洋大學(xué)
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/11;C12Q1/68;A61P31/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 張月光;林偉斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

馬氏珠母貝（Pinctadamartensii）是我國人工海水育珠的主要珍珠貝之一，近年 來因沿海水質(zhì)的日趨惡化，各種病害也頻繁發(fā)生，導(dǎo)致馬氏珠母貝因病害發(fā)生大量死亡，對 我國珍珠產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，了解馬氏珠母貝免疫機(jī)制并在此基礎(chǔ)上提高 馬氏珠母貝抗脅迫能力是目前亟需解決的問題。

無脊椎動物，不具備高等動物的特異性免疫系統(tǒng)，所以對于天然免疫分子凝集素 （Lectin）在體內(nèi)發(fā)揮免疫功能十分重要。凝集素普遍存在于生物體中，有糖基結(jié)合位點，是 一種專一性很強(qiáng)的糖蛋白或是結(jié)合糖的蛋白，能夠結(jié)合游離在溶液中的糖或是蛋白的某部 分，因具有凝聚血紅蛋白的功能，故而命名為凝集素。動物凝集素按照凝集素序列特征和生 物學(xué)功能特點主要分為C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素和五聚體凝集素 這五大類。其中，C-型凝集素是指活性必須依賴于Ca²⁺才能發(fā)揮作用，存在于所有后生動物 中。C-型凝集素的分布比較廣泛，在動物、植物、微生物，甚至病毒中都有發(fā)現(xiàn)C-型凝集素的 CRD結(jié)構(gòu)域的蛋白。具有糖結(jié)合位點使得C-型凝集素在生物學(xué)上發(fā)揮了很多重要作用，如細(xì) 胞粘附、內(nèi)吞作用以及免疫識別等功能。目前，關(guān)于馬氏珠母貝凝集素的研究比較少，胡鈺 婷從馬氏珠母貝中克隆得到PoLEC-1和PoLEC-2共2個C-型凝集素基因，但是凝集素在馬氏 珠母貝免疫系統(tǒng)中的作用還未見深入報道。研究馬氏珠母貝的凝集素不僅可以了解馬氏珠 母貝的免疫機(jī)制，做到疾病防治，還間接對人類的生活有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種馬氏珠母貝凝集素PmCLEC- 1。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1基因。

本發(fā)明的另一個目的是提供馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

一種馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2或3所示。SEQ IDNO:2所示序列為凝集素PmCLEC-1基因的DNA全長序列，全長636bp，包含39bp的5'UTR， 147bp的3'UTR。SEQIDNO:3所示序列為凝集素PmCLEC-1基因的開放閱讀框序列，開放閱讀 框450bp，編碼149個氨基酸。

本發(fā)明還提供所述馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1在抑制大腸桿菌和藤黃微球菌生 長中的用途。

另外，本發(fā)明設(shè)計了一對檢測如上所述馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1基因的熒光定 量引物，用于分析馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1基因在各組織中的表達(dá)情況，因此本發(fā)明要 求保護(hù)一對檢測如上所述馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1基因的熒光定量引物，引物的核苷酸 序列如SEQIDNO:4~5所示。

本發(fā)明還保護(hù)包含SEQIDNO:2或3所述馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1基因的重組 載體。本發(fā)明還保護(hù)包含如上所述重組載體的重組菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明以馬氏珠母貝為研究對象，運(yùn)用高效液相色譜儀對其血清進(jìn)行分離純化，篩選 出具有抑菌活性的蛋白，所獲得馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1能明顯抑制大腸桿菌和藤黃微 球菌的生長，通過質(zhì)譜測序，采用RACE技術(shù)克隆cDNA全長，獲得編碼馬氏珠母貝凝集素 PmCLEC-1的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2或SEQIDNO：3所示；馬氏珠母貝凝集素 PmCLEC-1基因cDNA全長636bp，包含39bp的5'UTR，147bp的3'UTR。SEQIDNO:3所示序列為 凝集素PmCLEC-1基因的開放閱讀框序列，開放閱讀框450bp，編碼149個氨基酸。

研究細(xì)菌刺激之后凝集素的mRNA在血淋巴中的時序表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過細(xì)菌刺激之 后，PmCLEC-1處于12h在血淋巴中表達(dá)含量最高，與其它時期具有顯著差異。之后下調(diào)，到 24h又上調(diào)一些，其它時間段都沒有什么變化。與馬氏珠母貝PoLEC1相比，它的變化明顯。說 明了PmCLEC-1參與了免疫作用，與免疫相關(guān)，本發(fā)明的馬氏珠母貝凝集素PmCLEC-1具有抑 制大腸桿菌和藤黃微球菌生長的作用。