[發明專利]一種突變的海藻糖合酶及其表達基因與應用

有效

• 申請號: 201610073828.9
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105524936B
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 蘇靜;李珍珍;王瑞明;張云霄
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/24;C12P19/12
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發明涉及一種突變的海藻糖合酶及其表達基因與應用。突變的海藻糖合酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。突變的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明首次根據(Pseudomonas stutzeri)Qlu3預測的三維結構為基礎，對其活性中心進行關鍵氨基酸的定點突變，獲得了海藻糖合酶的突變體蛋白，該突變的海藻糖合酶制備方法簡便，產量大，純度高，熱穩定性好，較野生型海藻糖合酶，突變體的海藻糖轉化率提高了4.5％，副產物葡萄糖的生成量降低了69.4％。

技術領域

本發明涉及一種突變的海藻糖合酶及其表達基因與應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

海藻糖是一種十分安全可靠的非還原性雙糖，費雷德里克率先應用核磁共振技術對其化學結構進行了探究，有2個吡喃型葡萄糖單體通過1,1糖苷鍵連結而成的雙糖。十九世紀上半葉由威格斯從一種黑麥的麥角菌中把海藻糖第一次提取獲得，并且已經證實了海藻糖對多種生物活性物質具有非特異性保護作用。又因為其耐干旱、抗低溫、抗嚴寒等特性，被很多人稱為“生命之糖”。海藻糖能使生物體忍受高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣的環境條件，原因是它能夠產生一種膜附著在細胞表面，較好地維持蛋白分子不發生變性，進而使得動植物生命特性得以存在。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優良活性保護劑以外，還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料。因此海藻糖可廣泛的應用到醫藥、化妝品業以及食品行業，具有誘人的開發應用前景和巨大的經濟效益。

鑒于海藻糖廣泛而重要的應用價值，尋找海藻糖高效方便、低成本生產方法的研究被廣泛重視。目前海藻糖的生產方法主要有酵母提取法、發酵法、酶合成法。其中酶法生產海藻糖具有較高的特異性和快速溫和等特點，已經成為研發海藻糖工業化生產的熱點并作為短期可見效的可行性途徑之一。

海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)是一種分子內葡糖苷轉移酶，它只需要一步反應就可以將麥芽糖的α-1,4糖苷鍵轉化為α-1,1糖苷鍵生成海藻糖。該酶反應流程短，易調控，不需要消耗高能物質，不需要磷酸鹽共存，只需要一種酶一步反應就能獲得海藻糖，因此海藻糖合酶轉化法是適宜工業化生產海藻糖的方法，有著良好的應用前景，受到廣泛的關注。到目前為止，國內外有報道的能夠產海藻糖合酶的微生物已經超過15種。不同微生物來源的海藻糖合酶的催化效率、酶學性質各有不同，但其在反應過程中均伴有副產物的產生，有的高達20％，一般為5％-10％左右，這對下游產物的分離純化帶來了難度，同時提高了海藻糖的生產成本。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種突變的海藻糖合酶及其表達基因與應用。該突變的海藻糖合酶副產物葡萄糖的生成量降低，海藻糖的轉化率提高。該海藻糖合酶由來源于施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)的海藻糖合酶經定點突變A309E獲得。

本發明技術方案如下：

一種突變的海藻糖合酶的表達基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。

一種突變的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明所述海藻糖合酶是通過Quick change定點突變的方法對關鍵氨基酸309位的丙氨酸突變為谷氨酸，然后轉入大腸桿菌進行高效表達后，利用鎳柱親和層析，離子交換層析，分子篩等一系列純化手段，最終獲得高純度的海藻糖合酶突變體蛋白。上述重組蛋白反應2h即可達到最大轉化率，海藻糖轉化率即可達到74.7％，副產物僅為1.1％。上述重組蛋白在50℃金屬浴中放置30min海藻糖轉化率依然可以達到51.2％。上述重組蛋白最適反應溫度為35℃。上述重組蛋白最適反應pH為7.0-8.0。

一種插入上述突變的海藻糖合酶的表達基因的重組載體。

一種轉基因細胞系，含有上述重組載體。