[發明專利]一種豬脂肪干細胞分離培養及鑒定的方法

在審

• 申請號: 201610073412.7
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105602896A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 楊素芳;韓杰;李海洋;鄧彥飛;石德順;朱鵬;楊海燕;韋精衛;李湘萍;黃奔
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12Q1/02;C12Q1/68;G01N15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種豬脂肪干細胞分離培養的方法，包括以下步驟：

1)將豬脂肪組織消化后進行細胞篩過濾，細胞篩過濾后進行梯度離心， 所述的細胞篩過濾和梯度離心重復兩次，然后進行細胞培養，

所述消化采用LiberaseTL進行，所述消化的溫度為37℃，時間為1～3h； 所述的LiberaseTL的濃度為15～25μg/mL，LiberaseTL與脂肪組織的體積比 為0.5～1∶1；

2)將所述培養得到的細胞進行傳代培養。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的脂肪組 織消化前還包括以下步驟：

采集豬脂肪組織；

將所述采集到的豬脂肪組織清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液為含有 0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L鏈霉素的PBS溶液。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪組織消化后還 包括終止消化，所述終止消化具體為：

使用含體積分數為7.5～15％FBS的低糖DMEM培養液終止消化，所述的 低糖DMEM培養液為葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培養液。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞篩過濾按照時 間順序包括第一細胞篩過濾和第二細胞篩過濾；

所述第一細胞篩過濾中細胞篩的孔徑為100μm，所述第二細胞篩過濾中 細胞篩的孔徑為70μm。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度離心按照時間 順序包括第一離心和第二離心；

所述第一離心的轉速為1000～1400rpm，所述第一離心的時間為8～12min；

所述第二離心的轉速為8000～1200rpm，所述第二離心的時間為8～12min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述傳代培養采用的培養 液為含有體積分數為7.5～15％％FBS的低糖DMEM培養液，所述的低糖 DMEM培養液為葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培養液。

7.一種豬脂肪干細胞的鑒定方法，包括以下步驟：

將豬脂肪干細胞進行生物學特性鑒定、表面抗原檢測和誘導分化檢測。

8.根據權利要求7所述的鑒定方法，其特征在于所述生物學特性鑒定包 括測定生長曲線、測定細胞集落和分析細胞核型。

9.根據權利要求7所述的鑒定方法，其特征在于：所述脂肪干細胞表面 抗原檢測前還包括：

將所述脂肪干細胞依次進行預消化和消化；

所述預消化采用LiberaseTL進行，所述LiberaseTL的濃度為 15～25μg/mL，所述預消化的時間為1～3min，所述預消化的溫度為37℃，所述 預消化的環境中的CO₂的體積比例為5％，所述預消化的環境中的濕度為飽 和濕度；所述消化采用胰蛋白酶和EDTA進行，所述胰蛋白酶的質量濃度為 0.25％，所述EDTA的質量濃度為0.03～0.05％，所述消化的溫度為37℃，CO₂飽和濕度為5％，所述消化的時間為1～3min。

10.根據權利要求7所述的鑒定方法，其特征在于，所述的脂肪干細胞 誘導分化檢測，包括以下步驟：

培養豬脂肪干細胞，當細胞匯合度達到80％-90％時，加入成脂誘導液、 成骨誘導液和成軟骨誘導液進行為期2～4周的成脂、成骨和成軟骨細胞誘導；

將誘導培養到期的細胞分別進行油紅O、茜素紅和阿爾新藍染色；

將誘導培養到期的細胞進行成脂特異性基因Ppar-2、成骨特異性基因 Osteocalcin和成軟骨特異性基因CollagenII檢測；

所述的油紅O、茜素紅和阿爾新藍染色和所述的成脂特異性基因Ppar-2、 成骨特異性基因Osteocalcin和成軟骨特異性基因CollagenII檢測之間無時間 順序限定。