[發明專利]核酸的檢測方法以及試劑盒、裝置

在審

• 申請號: 201610073182.4
• 申請日: 2010-03-15
• 公開（公告）號: CN105713968A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 宮本重彥;加藤智久;高橋孝治;友野潤
• 申請（專利權）人: 株式會社鐘化
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 沈雪

本申請是申請日為2010年3月15日、申請號為201080012366.0的中國發明申請“核酸的檢測方法以及試劑盒、裝置”的分案申請。

技術領域

本發明涉及能夠對通過核酸擴增方法擴增的核酸進行檢測的核酸檢測方法和試劑盒、裝置。

背景技術

在分子生物學研究領域、基因檢查等臨床應用領域中，特異性擴增靶標核酸片段的方法成為非常重要的技術。在這樣的基因擴增方法中，除了最通用的PCR法(PolymeraseChainReaction)以外，還開發出了無需PCR法中不可缺少的復雜溫度控制的LAMP(Loop-MediatedIsothermalAmplification)法、ICAN(lsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids)法等的等溫擴增方法。

作為通過PCR法、LAMP法、ICAN法等擴增出的特定核酸區域的檢測方法，大致可以分為對作為擴增產物的DNA進行檢測的方法、和對作為副產物的焦磷酸(二磷酸)進行檢測的方法這兩類。

檢測雙鏈核酸的最一般方法已知有對擴增反應后的溶液實施瓊脂糖電泳，使之結合EthidiumBromide、SYBRGreen等熒光性嵌入劑，并觀察特異性的熒光的方法(非專利文獻1)。但是，電泳后用EthidiumBromide等熒光性嵌入劑進行染色的方法需要30分～1小時左右的泳動時間，而且需要用于檢測熒光的紫外線照射裝置、熒光檢測器等昂貴的機械。

此外，作為無需進行電泳、而對PCR產物進行檢測和定量的方法，已知有通過預先在PCR開始前的反應液中添加熒光性嵌入劑，并使用熒光分光光度計測定熒光強度，來測定擴增DNA量的方法(專利文獻1)。但是，熒光性嵌入劑與引物等單鏈核酸結合，因而導致不依賴于雙鏈核酸量的背景信號增強、檢測靈敏度降低的問題。與此相對，已知有通過用優先與結合了單鏈核酸的嵌入劑反應的化合物進行處理，來降低背景信號的方法(專利文獻2)。但是，在采用這些方法的情況下，需要用于檢測熒光的裝置、設備。

作為上述以外的方法，例如已知有使用熒光標記的引物進行核酸擴增反應、并通過熒光偏光來檢測該核酸擴增產物的方法(專利文獻3)。但是，這需要對未進入擴增產物的熒光標記引物的分離操作，不僅煩雜，而且由于引物的分離操作，存在所得核酸擴增片段的收獲量減少、結果導致檢測靈敏度降低的隱患。此外，一般而言，標記核苷酸、標記引物非常昂貴，在成本方面也存在問題。

此外，還已知使偏振光通過核酸擴增反應中的反應液，并通過測定該偏振光的旋光度或圓偏光二色性來檢測核酸擴增產物的方法(專利文獻4)。但是，旋光度、圓偏光二色性的測定需要特殊裝置。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1:特開平5-237000號公報

專利文獻2:國際公開第2002/103053號

專利文獻3:特開平9-187275號公報

專利文獻4:特開2002-186481號公報

非專利文獻

非專利文獻1:MolecularCloningsecondedition,vol.1,6.15(1989)

發明內容

發明所要解決的問題

本發明的課題是提供：無需特殊裝置、簡便且高精度地目測檢測采用核酸擴增方法擴增的核酸的核酸檢測方法、和核酸檢測裝置或試劑盒。

解決問題的方法

本發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發現：通過在核酸擴增反應的前或后添加因與核酸結合而色調發生變化的染料，通過在可見光下進行觀察，能夠檢測核酸擴增的有無。而且獨立發現：通過添加與結合雙鏈核酸的染料相比、優先和與單鏈核酸結合了的染料、未與核酸結合的染料反應的化合物，改變或者消除來源于除了與雙鏈核酸結合了的染料以外的色調，能夠簡便且高精度地目測檢測上述核酸擴增片段。而且，還制作了利用本方法的目測核酸檢測試劑盒、裝置，從而完成了本發明。

即，本發明涉及包含在被檢物中的核酸的檢測方法，其包括：

(1)使被檢物與染料接觸并反應的步驟；

(2)在可見光下觀察該反應生成的物質，目測判定核酸的存在的步驟。

優選在所述步驟(1)的前或后包括使與染料反應的物質與被檢物接觸的步驟(3)。

所述染料優選是色調通過氧化劑、還原劑、酸、堿或pH緩沖劑的處理而發生變化的染料。

此外，本發明涉及包含在被檢物中的核酸的檢測裝置或試劑盒，其包含：