[發明專利]一株低毒力重組豬腦心肌炎病毒及其應用在審
| 申請號： | 201610072827.2 | 申請日： | 2016-02-02 |
| 公開（公告）號： | CN105647877A | 公開（公告）日： | 2016-06-08 |
| 發明（設計）人： | 白娟;方譜縣;姜平 | 申請（專利權）人： | 南京農業大學 |
| 主分類號： | C12N7/01 | 分類號： | C12N7/01;A61K39/125;A61P31/14 |
| 代理公司： | 濟南泉城專利商標事務所 37218 | 代理人： | 劉麗 |
| 地址： | 210014 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一株低 毒力 重組 豬腦 心肌炎 病毒 及其 應用 | ||
1.一株低毒力重組豬源腦心肌炎病毒，是通過以下步驟構建得到的：
（1）提取豬源腦心肌炎病毒株總RNA，RT-PCT擴增目的基因片段，擴增用引物如下
以豬源腦心肌炎病毒總RNA作為模板，以AR、B1R、B2R、以及CR1為特異性下游引物，構建反應體系獲得的A、B1、B2、C片段的cDNA，分別以AF/AR，B1F/B1R，B2F/B2R，CF/CR2為引物，相應的cDNA為模板進行PCR反應，獲得A、B1、B2、C四個片段，然后利用B1F/B2R為引物，將B1和B2片段進行融合反應，獲得B片段；
（2）將A、B、C片段分別與pEasy-simpleBlunt克隆載體進行連接，轉化感受態細胞，培養，提取陽性重組質粒，分別得到重組質粒pEasy-A、pEasy-B和pEasy-C；
（3）利用雙酶切的方法將C、B、A片段依次克隆至載體中，構建病毒全長cDNA克隆，
得重組質粒pCMV-NJ08；
（4）將重組質粒pCMV-NJ08轉染BHK-21細胞，經過培養得到豬源腦心肌炎病毒株感染性克隆rNJ08。
2.根據權利要求1所述的低毒力豬源腦心肌炎病毒，其特征在于rNJ08接種BHK-21細胞，連續傳代，第3、5、10代拯救病毒的TCID50為107.66~108.5TCID50/mL。
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